Intracellulaire opname, Sensory Velden bij, en het kweken geïdentificeerde neuronen in de Leech, Hirudo medicinalis</i

1. Bereiding van elektroden en zoutoplossing Bereid fysiologische zoutoplossing en elektroden voor het dier is ontleed. Leech Ringer-oplossing bestaat uit het volgende: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl2, 4,0 mM KCl, 10 mM Tris / maleïnezuur of HEPES. Breng de pH op 7,4. Bereid een Ag-Cl draad door dompelen gereinigde zilverdraad in een kleine hoeveelheid bleekmiddel voor 20 minuten of totdat de draad een gladde donkergrijze afwerking. Was de draad met gedestilleerd water voor het gebruik. Plaats vervolgens de draad in een micropipet houder die wordt aangesloten op de versterker. Bereid een scherpe glas elektrode van borosilicaatglas met een pipet trekker. De weerstand elektrode moet in de orde van 20 MQ. Opvulling van de pipet met 3 M kaliumacetaat oplossing en plaats in in de micropipet houder. Voor een extracellulaire elektrode bereiden een scherpe glazen pipet, zoals hierboven beschreven, breek de punt terug doorwrijven andere scherpe pipet in de buurt van de scherpe rand. Brand vervolgens polijst de tip zodat het niet scheurt de connectieven. Plastic extracellulaire elektroden zal ook zolang er is goed contact tussen de elektrode en de zenuw werken. Plaats de extracellulaire elektrode in een micropipet houder (Ag-Cl draad) die is voorzien van een rubberen buis en spuit voor afzuiging. De spuit met zoutoplossing trekken in de elektrode ten minste op het niveau van de zilverdraad. Installeren van de hardware (versterker en stimulus isolator) en software opname parameters door het volgen van de handleiding van uw specifiek signaal opname-eenheid. Zie Leksrisawat et al.. 22 tot en met details over de apparatuur die wordt gebruikt in de hieronder beschreven experimenten bekijken. 2. Ventrale ganglion Dissection Ontleden de bloedzuiger in een grote silicone-elastomeer beklede schaal met bloedzuiger Ringer-oplossing. Als het dier in langsrichting wordt gerekt zalmakkelijker om de buikzenuwkoord (zie figuur 1A) te verwijderen. Met # 10 of # 11 size scalpel een longitudinale incisie met zeer ondiepe sneden in het ventrale middellijn. Omstreeks het midden 2/3e van de ventrale snede wordt weergegeven in figuur 1B. Probeer niet te snijden door de zwarte kous (de ventrale bloed sinus), totdat het dier volledig is geopend en het bloed sinus wordt uitgerekt zonder knikken. Dit bloed sinus loopt de lengte van het dier langs de ventrale middellijn. De VNC is opgenomen binnenkant van deze bloedvat. Nadat de huid is gesneden van de volledige lengte van het dier gebruiken de boete iris schaar om nick het bloed sinus (figuur 2). Slip een blad van de boete iris schaar onder de sinus en het mes om het te scheiden van het zenuwweefsel lichtjes verhogen. Snijd de sinus van de lengte van de VNC, terwijl het vermijden van de zenuwwortels, segmentale zenuwen, of de connectieven tussen ganglia. Verwijder vervolgens een deel van de buikzenuwkoord doorsnijden van de wortels distale waar het bloedvat sluit de wortels. Herhaal dit proces voor elk ganglion over de lengte van de buikzenuwkoord. Breng een segment van een of twee ganglia een kleinere petrischaal. De ganglia of de enige ganglion moet strak met wat speling te worden vastgemaakt. Speld de connectieven en de wortels zodat het ganglion gliale schede iets wordt uitgerekt om te voorkomen dat het neuron cellichamen van bewegen wanneer gespietst door de gliale schede en in het neuron van belang. De pennen worden geplaatst door de zwarte sinus van de wortels en in het midden van de twee connectoren op beschadiging van axons (figuur 3) te minimaliseren. Plaats de petrischaal met de voorbereiding onder de microscoop en zet deze met was op de bodem van de schotel om verplaatsing te voorkomen. Richten de lichtbundel voorzichtig met een spiegel en lichte condensor de neuronen zien zoals in figuur 4A (schematisch weergegeven in figuur 4B </strong>). Let op de twee grote Retzius cellen in het midden van de ganglion. Om een ​​intracellulaire opname van de Rz, T, P en N neuronen, zorgvuldig plaats de punt van de elektrode in de cel plaats toe en laat de punt tot een uitholling gezien in de gliale schede. Tik de elektrode houder of manipulator (heel voorzichtig), zodat de elektrode tip "pops" in de cel van belang. Injecteren korte pulsen (30-40 msec) van positieve stroom (1-10 nA) in de cel om actiepotentialen te roepen. 3. Kweken neuronen van het ventrale ganglion Voorbereiding Speld de ganglia ventrale zijde naar boven in een schone schotel met L-15 met foetaal kalfsserum (FCS) (Figuur 3). Speld de wortels zodat de ganglia enigszins uitgerekt zoals hierboven gedaan voor intracellulaire opnames. Met fijne schaar, nick de gliale capsule aan de ene kant, zet een schaar mes onder de capsule, daarna dwars door de gliale capsulezoals getoond in figuur 5A. Voeg 100 ul aliquot van Collagenase / Dispase om de schotel en leg ze op een shaker gedurende 15 minuten. Onderzoek cellen in door de kweekmedia rond de blootgestelde cellichamen. De terugkeer van de cellen naar de shaker nog 15 min of langer totdat de cellen naar buiten komen met minimale zuigkracht. Gebruik een pipet bevestigd aan een injectiespuit zachtjes extraheren cellen van het ganglion. Brand polijst de pipetpunt zodat het iets groter dan de diameter cellichaam. Voor Rz cellen in een volwassen bloedzuiger, moet de diameter van ongeveer 50 urn. Bereid een verscheidenheid van pipetten met verschillende diameters zonder filament omdat dit vermindert de kans dat de cellen steken in de pipet. Bewaar de pipetten in een fles met 80% ethanol (EtOH) met behulp van een katoenen bal aan de onderkant om de tips te beschermen tegen chippen. Vergeet niet om de EtOH wassen van de pipet met medium voor het opzuigen van cellen. Na het enzym behandeling, was deenzym-bevattend medium met L-15 (met FCS) 2x. Identificeer de cellen van belang en ze zachtjes te trekken in de pipet door het trekken van de spuit (figuur 6A). Ontladen van de opgezogen cellen in een ander gerecht die L-15 bevat (met FCS). Tot nu alle procedures waren niet-steriel. Voer de volgende stappen in een steriele kap. Plaats 3-4 grote druppels steriel L-15 (met FCS) op verschillende locaties in een steriele petrischaal. Pipetteer de cellen in een van de hiervoor genoemde druppels, blazen ze rond de druppel te wassen. Herhaal deze in serie 3 of 4 druppels drager. Plaats cellen in een schone petrischaal gevuld met L-15 (met FCS). Incubeer de cellen gedurende 1-24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Daarna de schone cellen kunnen worden verzilverd. Bij het verlaten van de cellen gedurende enkele uren of een nacht de extracellulaire matrix komt gemakkelijk af. Plate de cellen onmiddellijk langer processen te genereren. Gebruik steriel substraat voor het bekleden van een microwell di sh en laat het volledig drogen ('s nachts) voor het kweken van experimenten. Nadat de schaal is bekleed, was de schaal voorzichtig met steriel water en vervolgens met een kleine hoeveelheid van het L-15 medium. Vergeet niet om de L-15-oplossing te gebruiken zonder de FCS toegevoegd om de cellen te hechten aan het gerecht. Het medium kan voorzichtig worden gewijzigd in L-15 met FCS nadat de cellen gehecht aan het substraat. Als de cellen worden gebruikt een paar uur na uitplaten, dan schakelen het medium L-15 met FCS is niet noodzakelijk. Plaats de cellen naast elkaar op het uitplaten snelle synaptogenesis (figuur 6B) induceren. Na 24 uur maatregel fysiologische activiteit in paringen van neuronen. Gebruik intracellulaire elektrofysiologische technieken om RP of synaptische reacties opnemen in gekweekte paren van cellen (stimuleren 1 neuron door een intracellulaire elektrode en opnemen reacties van de gepaarde cel met behulp van een 2 intracellulaire elektrode). titel "> 4. ganglion-body Muur Voorbereiding Speld de bloedzuiger dorsale zijde in een elastomeer beklede schaal zoals hierboven beschreven. Speld de huid aan een kant met wortels op de andere kant van het gescheiden ganglion (fig. 7A, vergroot in figuur 7B) of een venster op het ventrale aspect van de bloedzuiger over een ganglion (fig. 7C) met de wortels het lichaam wand intact. Na het verkrijgen van een stabiele intracellulaire opname in een van de zintuigcellen (T, P, N) met een kleine glazen staaf die is vuur gepolijst om de huid in hetzelfde segment licht aan te raken. Als het neuron wordt opgenomen uit een N-cel dan meer druk moeten worden toegepast op de huid. In de meeste gevallen zal de N cel alleen reageren als de huid wordt geknepen met een pincet. Daarom deze laatste cellen moet worden geprobeerd als een huid kan beschadigen of verdringen intracellulaire hercoderen van het preparaat zodanig verstoren. Men moetstaat om snel de huid en ganglion voldoende gegevens voldoende schetsen die een kaart waar men aangeraakt kan worden gebruikt om het receptieve veld bepalen voor een bepaald neuron. Na het opnemen van zo veel T-en P-cellen mogelijk aan beide zijden van een ganglion probeer de N cellen. Om te onderzoeken of de sensorische neuronen hebben processen die reizen door de connectieven in een rostrale of caudale wijze en vervolgens uit de wortels in het aangrenzende segment van de huid, kan de connectieven tussen ganglia worden gesneden en de receptieve velden opnieuw onderzocht met betrekking tot de verspreiding van detectie. In principe een onderzoekt of er een verlies in het receptieve veld is. 5. Het injecteren van fluorescente kleurstoffen Bereid een bloedzuiger ganglion zoals hierboven beschreven. Vul een micro-elektrode met een oplossing van Lucifer geel-CH (3,0%) en lithiumchloride (300 mM). Spietsen een van de sensorische cellen of Rz cellen aan de buikzijde van het ganglion beschrevenhierboven. Injecteer kleurstof in de cel door het passeren negatieve stroom (3Na) door de elektrode voor 15 minuten. Stel de pulsduur van 100 msec en de frequentie 2 Hz. Visualiseer de kleurstof gevuld neuronen door spannende de kleurstof met een kwiklamp en een FITC / GFP filter set.