Выделение и характеристика области липида А липополисахарида (ЛПС) из грамотрицательных бактерий дает представление о клеточной поверхности механизмов, основанных устойчивости к антибиотикам, выживаемости бактерий и пригодности, и как химически разнообразны липид А молекулярные частицы дифференциально модулировать хост врожденные иммунные реакции.
Липополисахарид (LPS) является основным молекулу клеточной поверхности грамотрицательных бактерий, наносят на наружный листок наружной мембраны бислой. ЛПС можно разделить на три области: дистальный О-полисахарида, основной олигосахаридными и липидов область, состоящая из липида A молекулярные частицы и остатки 3-дезокси-D-манно-окт-2-ulosonic кислоты (КДО). Домен липидов является единственным компонентом важное значение для выживания бактериальной клетки. После его синтеза, липидов химически модифицирован в ответ на экологических стрессов, таких как рН или температуры, в целях содействия устойчивость к антибиотикам соединений, и уклониться от признания медиаторов принимающей врожденного иммунного ответа. Ниже подробно описывается протокол малого и масштабный изоляцию липида А из грамотрицательных бактерий. Изолированный материал затем химически охарактеризован с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) или масс-спектрометрии (МС). В дополнение к матрице-лазерной десорбцией / ионизации-время фсвет (MALDI-TOF) МС, мы также описать тандем MS протоколы для анализа липида А молекулярные частицы с помощью ионизации электрораспылением (ESI), соединенный с столкновения индуцированной диссоциации (CID) и вновь принятых на работу ультрафиолетовое фотодиссоциацию методы (UVPD). Наши протоколы MS позволяют однозначного определения химической структуры, первостепенное значение для характеристики липидных молекул А, которые содержат уникальные или новые химические модификации. Мы также описываем радиоизотопное мечение, и последующее выделение, из липида А из бактериальных клеток для анализа с помощью ТСХ. По сравнению с протоколами MS на основе ТСХ обеспечивает более экономичный и быстрый метод характеризации, но не могут быть использованы для однозначно назначать липида А химические структуры без использования стандартов известной химической структуры. За последние два десятилетия выделение и характеристика липида А привело к многочисленным захватывающих открытий, которые улучшили наше понимание физиологии грамотрицательных бактерий, механизмов сопро антибиотиковрасстояние, человеческий врожденного иммунного ответа, и предоставили много новых целей в развитии антибактериальных соединений.
Липополисахарид (LPS) является основным внешняя поверхность молекула почти всех грамотрицательных микроорганизмов и состоит из трех доменов: молекулярных дистальный O-антиген полисахаридов, основной олигосахаридных, и мембранно-связанный липидов домена осаждается на внешней створки Внешняя мембрана двухслойная 1,2. Липидный домен состоит из 3-дезокси-D-манно-окт-2-ulosonic (KDO) остатков и липида A видов молекул, где липид может быть определена как хлороформ растворимой части ЛПС при легкой кислотного гидролиза 1, 2. Стандарт липидов молекула может быть химически определяется как diglucosamine позвоночника, что является гекса-ацилирована и бис-фосфорилируются; согласуется с основными видами липида А, наблюдаемых в модель организма кишечной палочки (E.coli) 1,2. Девять конституитивно выраженные гены, консервативные по всей грамотрицательных бактерий, несут ответственность за производство липидов домена (рис. 1) 1,2. Большинство бактерий имеют дополнительный набор генов, которые изменяются в степени филогенетического сохранения, что участвовать в дальнейшей химической модификации липидов 3. Дефосфорилирование, удаление ацильных цепей, и добавление химических групп, таких как аминосахаров (например aminoarabinose) и / или фосфоэтаноламин являются наиболее часто наблюдается деятельности (рис. 1). Многие из ферментов, ответственных за липидов модификации непосредственно активировать окружающей среды сигналов, таких как двухвалентные катионы, или их экспрессия регулируется двухкомпонентных ответ-регуляторных систем 3.
Признание видов липидов А принимающей врожденной иммунной системы опосредуется звонок подобный рецептор фактора 4/myeloid дифференциации 2 (TLR4/MD2) корецептора 4. Гидрофобные силы между MD2 и липида A ацильных цепей, а также между TLR4 и 1 и 4 'фосфатными группами липида А способствующих сильную связь для губID с TLR4/MD2 4,5. Модификации, которые изменяют состояние ацилирования или отрицательный заряд липидов липидов на основе воздействия TLR4/MD2 признание и вниз по течению стимуляция врожденного иммунного ответа активаторы NF-kB и медиаторы воспаления, такие как TNF-и IL-1 β 6,7. Модификации, которые маскируют отрицательный заряд липида А также предотвратить бактерицидными катионные антимикробные пептиды от привязки к грамотрицательных поверхности клеток 3,8. Многие модификации липидов A предположили увеличить бактериальную фитнес при определенных условиях окружающей среды, таких как внутри человеческого организма или в экологической ниши. По этой причине многие модификации ферменты привлекательными объектами в рациональной разработке антимикробных соединений. Химический разнообразие структур липида А, в отношении организма и / или окружающей среды и биологических последствий этих различных структур сделать структурную характеристику липида А важным стремиться в тон изучению грамотрицательных бактерий.
Выделение молекул липида А из цельных бактерий включает экстракцию ЛПС от поверхности бактериальной клетки, стадии гидролиза, чтобы освободить липидный A, с последующим окончательным процедуры очистки 9-11. Наиболее часто приводимые ЛПС процесс экстракции процедура забора воды горячей фенол, впервые введенная Вестфаль и Янн 10. После экстракции весь LPS подвергают легкой кислотного гидролиза, который химически отделяет Kdo от 6'-гидроксила дистального глюкозамина сахара липида А (рис. 1). Существует множество подводных камней для процедуры воды горячей фенола том числе с использованием высокой реагента опасности, необходимость ухудшить сотрудничество извлеченные нуклеиновых кислот и белков, и несколько дней, необходимых для завершения протокол 10.
Наша лаборатория дальнейшее развитие добычи и изоляцию липида А как впервые разработана Карофф и Raetz 12,13. По сравнению с процедурами горячей воды фенол, метод, представленный здесь является более быстрым и эффективным, и вмещает широкий спектр объемов культуры от 5 мл до нескольких литров. Кроме того, в отличие от экстракции горячей фенольных водных, наш метод не выбрать для грубых или гладких-типов ЛПС, обеспечивая оптимальное восстановление видов липидов А. В нашем протокола, химической лизис бактериальных клеток целых выполняется с использованием смеси хлороформа, метанола и воды, где LPS может быть осаждают центрифугированием. Сочетание гидролиза легкой кислоты и экстракции растворителем (Блай-Дайер) используются, чтобы освободить липидный А из ковалентно связанного полисахарида. Способ Блаем и Dyer впервые был применен к добыче видов липидов из различных животных и растительных тканей 14, модифицированный здесь, чтобы отделить гидролизованный полисахарид из липидов А. В этом заключительном этапе разделения, хлороформ растворимые липиды селективно разделить на нижний органический фаза. Для дальнейшей очистки липид А, с обращенной фазой илиАнионный обмен колоночной хроматографии можно использовать 12.
После выделения липидов А из видов целых клеток, ряд аналитических методов может быть использован, чтобы охарактеризовать химическую структуру изолированного материала, такого как ЯМР, ТСХ и МС на основе анализа. ЯМР позволяет неразрушающего структурного анализа, и обеспечивает структурную деталь, связанную с гликозидных связей, однозначного присвоения ацильных позиций цепи, и назначение участков присоединения для липидных модификаций А как aminoarabinose или фосфоэтаноламин 15-17. ЯМР-анализ липида А не обсуждается в рамках нашего протокола, но был описан адекватно в другом месте 15,16. Для экспресс-анализа ТСХ Методы, основанные на часто используются, но не в состоянии обеспечить прямую информацию о тонкой химической структуры. Протоколы, основанные МС наиболее часто используется метод для характеристики структуры липидов 18,19. Матрица связано с лазерной десорбцией ионизации (MALDI)-MS часто используется для обследования первоначально интактные видов липида А. Однозарядных ионов сгенерированы анализируемого вещества, полученного в соответствии с нашими процедурами экстракции. Как требуется более тонкая структурный анализ, методы, основанные MS / MS оказаться более информативным, чем MALDI-MS. В сочетании с ионизацией электрораспылением (ESI), отдельно или многозарядных липид А ионы-предшественники являются еще фрагментирован на столкновения индуцированной диссоциации (CID) или ультрафиолетового фотодиссоциации (UVPD), для генерации структурно информативные ионы продукта 18,20,21. Обычный потери продуктов из липида А предшествующих ионов также часто генерируется во время ESI-MS обеспечивает дополнительный слой структурной информации.
Масс-спектрометрия Тандем (MS / MS), оказалось, незаменимым и универсальным методом для выяснения структуры липида А. Во MS / MS, ионы активируются, чтобы получить диагностическую картину фрагментации, которая может использоваться для выяснения структуру иона-предшественника. Наиболее широко лавинтестированию нет доступа метод MS / MS является CID. Этот метод производит ионы фрагментов через столкновениях выбранного иона-предшественника с инертным целевого газа, в результате чего энерговклада, что приводит к диссоциации. CID доказала критический инструмент в присвоении липидной структуры A для широкого круга видов бактерий 22-33.
Хотя CID является наиболее широко реализованы способ МС / МС, он генерирует ограниченный спектр ионов продукта. 193 нм UVPD является альтернативой и дополнительный метод MS / MS. Этот метод использует лазер для облучения ионами, и поглощение фотонов приводит к подаче напряжения ионов и последующей диссоциации. Это более высокая энергия MS / MS техника производит более разнообразные ионов продукции, чем CID и таким образом обеспечивает более информативные модели фрагментации. В частности, UVPD дает информацию о тонких изменений в видов липидов А на основе раскола в гликозидной, амин, ацил и CC облигаций, привязанных к 18,21,34.
В этом протоколе мы подробно изоляцию липидных видов А из целых клеток бактерий, и описаны TLC или аналитические методы, основанные MS химически характеризуют этот изолированный материал. Тандемной масс-спектрометрии является мощной стратегией для процессов нового структурной хар…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами AI064184 и AI76322 от Национальных Институтов Здоровья (NIH) и Грант 61789-MA-МУР от Research Office армии к MST исследований была также поддержана Welch Foundation Grant F1155 и NIH грант R01GM103655 в АБ
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
Mass Spectrometer | |||
ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |