Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

Lipopolysaccharide (LPS) is het belangrijkste buitenoppervlak molecuul bijna alle Gram-negatieve organismen en bestaat uit drie moleculaire domeinen: een distaal O-antigeen polysacharide, een kern oligosaccharide en de membraan-geassocieerde lipide A domein afgezet op de buitenste laag van de buitenste membraan dubbellaag ^1,2. De lipide A-domein bestaat uit 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) residuen en een lipide A moleculaire species, waarbij lipide A kan worden gedefinieerd als de chloroform oplosbare gedeelte van LPS bij milde zure hydrolyse ^{1, 2.} De standaard lipide A molecuul kan chemisch worden gedefinieerd als een diglucosamine backbone die hexa-geacyleerd en bis-gefosforyleerd, in overeenstemming met de grote lipide A species waargenomen in het modelorganisme Escherichia coli (E. coli) ^1,2. Negen constitutief tot expressie gebrachte genen, geconserveerd Gram-negatieve bacteriën zijn verantwoordelijk voor de productie van de lipide A-domein (Figuur 1) ^1,2. De meeste bacteriën hebben een extra set van genen, die variëren in de mate van fylogenetische conservering, die deelnemen aan verdere chemische modificatie van lipide A ^3. Defosforylering, verwijdering van acylketens, en de toevoeging van chemische groepen zoals amino suikers (bijv. aminoarabinose) en / of fosfo zijn de meest waargenomen activiteiten (figuur 1). Veel van de enzymen verantwoordelijk voor lipide A modificatie rechtstreeks geactiveerd door signalen uit de omgeving, zoals tweewaardige kationen, of de expressie wordt gereguleerd door twee componenten respons-ademautomaatsystemen ^3.

Erkenning van lipide Een soort door de gastheer aangeboren immuunsysteem wordt gemedieerd door de Toll-like receptor 4/myeloid differentiatie factor 2 (TLR4/MD2) co-receptor ^4. Hydrofobe krachten tussen MD2 en de lipide A acylketens, en tussen TLR4 en de 1 en 4 'fosfaatgroepen van lipide A bevorderen de sterke associatie van lipid A met TLR4/MD2 ^4,5. Modificaties die acylering staat of de negatieve lading van lipide A invloed TLR4/MD2 gebaseerd lipide veranderen Een erkenning en stroomafwaarts stimulatie van de aangeboren immuunrespons activatoren NF-kB en ontstekingsmediatoren zoals TNF en IL1-β ^6,7. Wijzigingen die de negatieve lading van lipide A maskeren voorkomen ook bacteriedodende kationische antimicrobiële peptiden binden aan celoppervlak-negatieve Gram ^3,8. Veel lipide A modificaties worden verondersteld om bacteriële film onder specifieke milieuomstandigheden, zoals in de menselijke gastheer of in een ecologische niche verhogen. Om deze reden veel modificatie enzymen zijn een aantrekkelijk doelwit in de rationele ontwikkeling van antimicrobiële verbindingen. De diversiteit van chemische structuren lipide A met betrekking tot organisme en / of omgeving en de biologische gevolgen van deze verschillende structuren structurele karakterisatie van lipide A een belangrijke inspanning in thij studie van gram-negatieve bacteriën.

Isolatie van lipide A moleculen uit hele bacteriën omvat de extractie van LPS uit het bacteriële celoppervlak, een hydrolytische stap lipide A bevrijden, gevolgd door een laatste zuiveringsprocedure ^9-11. De meest genoemde LPS extractie procedure is de hete-fenol water extractie procedure, voor het eerst geïntroduceerd door Westphal en Jann ^10. Na extractie geheel LPS onderworpen aan milde zure hydrolyse, die chemisch scheidt Kdo van de 6'-hydroxylgroep van het distale glucosamine suiker van lipide A (Figuur 1). Talrijke valkuilen bestaan ​​voor de warm-fenol water procedure, inclusief het gebruik van een groot gevaar reagens, de noodzaak van co-geëxtraheerde nucleïnezuren en eiwitten, en verscheidene dagen afgebroken moeten het protocol ¹⁰ voltooien.

Ons laboratorium heeft verder ontwikkeld de extractie en isolatie van lipide A als eerste ontwikkeld door Caroff en Raetz ^12,13. In vergelijking met procedures warm-fenol water, de hier gepresenteerde methode is snel en efficiënt en biedt een breed scala aan cultuur volumes van 5 ml tot meerdere liters. Bovendien, in tegenstelling warm-fenol water extracties, onze methode niet kiezen voor ruwe of gladde types van LPS, het verstrekken van optimaal herstel van lipide A soorten. In het protocol wordt chemische lysis van hele bacteriecellen uitgevoerd met een mengsel van chloroform, methanol en water, waar LPS kan worden gepelleteerd door centrifugatie. Een combinatie van milde zure hydrolyse en oplosmiddel extracties (Bligh-Dyer) worden gebruikt om lipide A bevrijden van covalent gebonden polysaccharide. Werkwijze volgens Bligh en Dyer werd eerst toegepast op de winning van lipide soorten van verschillende dierlijke en plantaardige weefsels ^14, hier aangepast om gehydrolyseerde polysaccharide scheiden van lipide A. In dit laatste scheidingsstap, chloroform oplosbare lipiden selectief verdelen in de onderste organische fase. Om verder te zuiveren lipide A, omgekeerde-fase ofanionische kolom-chromatografie kan worden gebruikt ^12.

Na isolatie van lipide A soort uit gehele cellen, kan een aantal analytische methoden worden gebruikt om de chemische structuur van het geïsoleerde materiaal zoals NMR, TLC en MS-gebaseerde analyse karakteriseren. NMR zorgt voor niet-destructieve structuuropheldering en biedt constructieve details over glycosidebindingen, ondubbelzinnige toewijzing van acylketen posities en toewijzing van bevestigingsplaatsen voor lipide A aanpassingen zoals aminoarabinose en fosfoethanolamine ^15-17. NMR-analyse van lipide A niet in ons protocol beschreven, maar is voldoende ^15,16 elders beschreven. Voor een snelle analyse TLC-gebaseerde methoden worden vaak gebruikt, maar niet om directe informatie over fijne chemische structuur te bieden. MS gebaseerde protocollen zijn de meest gebruikte methode om lipide A structuren ^18,19 karakteriseren. Matrix geassocieerd laser desorptie ionisatie (MALDI)-MS wordt vaak gebruikt om aanvankelijk overzicht intact lipide A soort. Enkelvoudig geladen ionen worden gegenereerd analyt bereid volgens onze extractieprocedures. Naarmate er meer fijne structurele analyse is nodig, MS / MS-gebaseerde methoden blijken informatiever dan MALDI-MS. Gekoppeld aan ionisatie electrospray (ESI) enkelvoudig of meervoudig geladen lipide A precursorionen verder versnipperd door botsing geïnduceerde dissociatie (CID) of ultraviolet fotodissociatie (UVPD), structureel informatieve product ionen ^18,20,21 genereren. Neutrale verlies producten van lipide A precursor ionen worden ook vaak ontstaan ​​tijdens ESI-MS voorzien van een extra laag van structurele informatie.

Tandem massaspectrometrie (MS / MS) blijkt een onmisbaar en veelzijdige werkwijze voor de opheldering van lipide A structuren. Tijdens MS / MS worden ionen geactiveerd op een diagnostische fragmentatie patroon dat kan worden gebruikt om de structuur van het precursorion helderen opleveren. De meest available MS / MS methode is CID. Deze methode levert fragment ionen via botsingen van de geselecteerde precursorion met een inert doelgas, waardoor energie depositie die leidt tot dissociatie. CID heeft bewezen een kritiek hulpmiddel in de opdracht van lipide A structuur voor een groot aantal bacteriesoorten ^22-33.

Hoewel CID is de meest algemeen ingevoerd MS / MS methode, genereert een beperkte reeks producten ionen. 193 nm UVPD is een alternatieve en complementaire MS / MS methode. Deze werkwijze gebruikt een laser om ionen bestralen en de absorptie van fotonen gevolg bekrachtiging van de ionen en daaropvolgende dissociatie. Deze hogere energie-MS / MS techniek levert een meer divers aanbod van product-ionen dan CID en zorgt zo voor meer informatieve fragmentatiepatronen. In het bijzonder, UVPD biedt informatie over subtiele veranderingen in lipide Een soort gebaseerd op breuklijnen in glycoside, amine, acyl-en CC-linked bonds ^18,21,34.