Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen
Summary
Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.
Abstract
Lentivirale vectoren (GW) zijn een krachtig middel van het leveren van genetisch materiaal naar vele soorten cellen. Vanwege de bezorgdheid over de veiligheid in verband met deze HIV-1 afgeleide vectoren, het produceren van grote hoeveelheden EGW is uitdagend. In dit artikel beschrijven we een methode voor het produceren van hoge titers van zelf-inactiverende LVs. We retroviraal transduceren de tet-off stabiele productiecellijn GPR een cellijn, GPRS, waarbij alle virale componenten, zoals een dendritische cel-specifieke glycoproteïne, SVGmu kan expressie brengen. Vervolgens gebruiken we concatemere DNA transfectie van de LV overdracht plasmide coderend transfecteren reportergen GFP in combinatie met een selecteerbare merker. Verscheidene van de resulterende klonen LV produceren een titer 10 maal groter dan wat we bereiken met voorbijgaande transfectie. Bovendien, deze virussen efficiënt transduceren van dendritische cellen in vitro en genereert een sterke T-cel immuunrespons op onze reporter antigeen. Deze methode kan een goede optie zijn for tot sterke LV-gebaseerde vaccins voor klinische studies van kanker of infectieziekten.
Introduction
Veel vectorsystemen ontwikkeld voor genaflevering. Vectoren op basis van lentivirussen zijn tot de meest bestudeerde viraal systeem. Deze vectoren zijn voordelig omdat ze efficiënt transduceren zowel delende als niet-delende cellen 1, langdurige expressie bereiken door integratie in het gastheergenoom, vertonen lage natuurlijke anti-vector immuniteit meeste menselijke populaties 2, en hebben een gering genotoxiciteit van insertiemutagenese 3,4.
Productie van lentiviruses is altijd gekleurd is door bezorgdheid over de veiligheid. Lentivirale vectoren zijn over het algemeen afkomstig zijn van HIV-1, het etiologische agens van AIDS. Transiënte transfectie van individuele componenten van de lentivector (transfer, enveloppen en verpakkingen plasmiden) is een veel voorkomende en soepelheid van afleveren van genetisch materiaal in laboratoriumsituatie. Echter, opschaling voorbijgaande transfecties voor klinische toepassingen is omslachtig en may leiden tot de ontwikkeling van replicatie-competent lentivirus 5,6. Om deze hindernissen te overwinnen, hebben diverse stabiele verpakking en producer cellijnen ontwikkeld 6-11. Een van deze lijnen, de GPR verpakkingslijn 11, heeft het aantrekkelijke voordeel van de regels van het tetracycline. In dit artikel laten we zien hoe dit systeem aan te passen aan zichzelf inactiveren lentivirale vectoren die specifiek gericht zijn in de richting van dendritische cellen (DC-GW) 12 te produceren.
Dendritische cellen (DCs) zijn de meest krachtige antigeen-presenterende cellen van het immuunsysteem. Zij hebben het onderwerp van groot belang bij kanker vaccin ontwikkeling, omdat ze direct te starten, het programma, en de regulering van tumor-specifieke immuunrespons 13. Waarin een vaccinatie protocol te nemen DCs heeft het potentieel om een sterkere antitumor immuunrespons dan peptide of DNA vaccins wekken. Onlangs hebben we een lentivirale vector ontwikkeld die specifically richt dendritische cellen met een gemodificeerd sindbis virus glycoproteïne, SVGmu 14. Deze vectoren zijn uniek omdat ze tonen hoge specificiteit voor dendritische cellen en het genereren sterker dan niet-specifieke immuunresponsen, VSVg-pseudotype vectoren.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het produceren van grote hoeveelheden van deze DC-gerichte lentivirale vectoren. We tonen aan dat deze DC-LVs DCs kunnen infecteren en het genereren van een sterke CD8 + T-cel immuunrespons. Alle procedures waarbij dieren werden humane wijze uitgevoerd, onder goedkeuring van de USC Intitutional Animal Care en gebruik Comite. Om uit te voeren in vivo of klinische experimenten is het essentieel om een cellijn die kan produceren virus met hoge titer te creëren. Het uitvoeren van de transductie en transfectie stappen precies zoals beschreven zal maximaliseren van de kansen van een dergelijke kloon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben wij een werkwijze voor het produceren van grote hoeveelheden lentivirale vectoren met 293T cellen die stabiel getransduceerd met lentivirale componenten onder de tet-off regelgeving geschetst. Tot dusver zijn de meeste protocollen lentivirale vectoren gebaseerd op standaard calciumfosfaat transiënte transfectie (zie 18 bijvoorbeeld). Deze aanpak is succesvol op klinische schaal zijn, maar kunnen lijden aan een aantal beperkingen waarschijnlijkheid niet in opschaling productie van stabiele cellijn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Michael Chou, Bingbing Dai, en Liang Xiao erkennen voor het bijdragen gegevens voor dit manuscript. Wij erkennen ook Dr John Gray voor de gulle giften van de reagentia gebruikt in deze studie. PB wordt ondersteund door een post-doctorale beurs van de National Cancer Center. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 en RCA170820A), een subsidie van de Bill en Melinda Gates Foundation, een translationele versnelling subsidie van het Joint Center for Translational Medicine en een subsidie van de California HIV / AIDS Research Program.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
