Выделение, очистка и маркировки Мышь нейтрофилов костного мозга для функциональных исследований и приемных Эксперименты Трансфер

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов у людей. Они являются основным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и выступают в качестве первой линии защиты от вторжения микроорганизмов. Пациенты с приобретенными нейтропения и первичных иммунодефицитов, которые влияют нейтрофилов номера и / или функции развиваются угрожающие жизни инвазивных бактериальных и грибковых инфекций, подчеркнув важность этих клеток в иммунной защиты ^1. Иммунный признание вторжения патогенных микроорганизмов на инфекцию сайта, их родственными распознавания рецепторами приводит к индукции организованной врожденный иммунный ответ, что приводит к секреции хемоаттрактанты которые генерируют градиента хемотаксических способны вербовку нейтрофилов из крови в воспаленную ткань ² . После нейтрофилов ввести инфекцию сайт, они активизируются, что приводит к цитокинов и хемокинов, патоген поглощение, и убивают через окислительную и неокислительный меняchanisms ^3. Кроме того, их хорошо узнаваемая роль во врожденном иммунитете, нейтрофилы также недавно было показано, играют важную роль в качестве инициаторов эффективной адаптивного иммунного ответа ^4. С другой стороны, помимо их роли в защитный иммунитет, нейтрофилы могут также посредником повреждение тканей и иммунопатологии из-за чрезмерного накопления и / или активации на участках воспаления, как показано в различных инфекционных и аутоиммунных заболеваний ^5-7.

Несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в монтаже эффективной врожденного иммунного ответа и их плейотропную эффекторных функций многих инфекционных заболеваний и воспалительных состояний, технические трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов препятствовал исследование с нейтрофилов в течение последних десятилетий. Таким образом, использование воспроизводимых анализов для выделения нейтрофилов должно облегчить дальнейшее исследование нейтрофилов-опосредованного immunoloческие функции бывших естественных условиях и в естественных условиях. На сегодняшний день несколько методов были описаны для выделения нейтрофилов, такие как центрифугирование в градиенте плотности крови человека и мыши крови или костного мозга ^8,9, положительный или отрицательный иммуномагнитного обогащение нейтрофилов из крови мыши или костного мозга ^10,11, и сбор нейтрофилов из брюшной полости мышей после внутрибрюшинной инъекции тиогликолята или других противовоспалительных агентов ^12. Хотя нейтрофилов может быть легко выделено в больших количествах из крови человека, этот метод является оптимальным у мышей из-за ограниченного объема крови мышей, что исключает выделение достаточного нейтрофилов для функциональных исследований или приемные экспериментов передачи ^13. Кроме того, хотя выход тиогликолята-вызывали клетки из брюшной полости больше по сравнению с крови мышей, чистота нейтрофилов в воспалительном перитонеального лаважа изменяется между60-90%, а изолированный нейтрофилы проявляют активированный фенотип. Таким образом, клетки собирали с использованием этого метода может быть использован только для выполнения функциональных исследований активированных но не стимулированных нейтрофилов, как мышь брюшную полость имеет несколько нейтрофилов в стационарном состоянии ^12. Вместо этого, костный мозг является удобным резервуар для сбора большого количества или стимулированных или активированный ^11,14 нейтрофилы, которые затем могут быть использованы для последующих функциональных исследований, таких как фагоцитоз, убийства и дегрануляции или для приемных передачи в получатель мышей.

Здесь мы описываем простой и быстрый (~ 2 ч) протокол, который обеспечивает высокий выход (~ 6-12 × 10 ⁶ нейтрофилов / неинфицированных мышей, или до 30-40 × 10 ⁶ нейтрофилов / инфицированные мыши) чистого (80 -95%) нейтрофилов> 95% жизнеспособность из костного мозга. Этот метод использует коммерчески доступные Histopaque, которые в градиенте плотности ячейки отдельнорацион сред, состоящих из Ficoll и натрий диатризоат, отделить нейтрофилов из костного мозга мышей. Этот метод дает значительно большее количество нейтрофилов на мышь по сравнению с полостью крови или перитонеального, он может быть использован для сбора нейтрофилов у мышей и в стационарном состоянии или после инфекции и легче слое по сравнению с центрифугирование в градиенте плотности метод, который использует прерывистый перколлом градиенты, состоящий из 55% / 65% / 75% Percoll в PBS ^9. Кроме того, время и ресурсы, необходимые для сбора чистой нейтрофилов значительно снизился по сравнению с выделения нейтрофилов с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток. Кроме того, поскольку этот способ не включать иммуномагнитного шаг обогащения, это более экономически эффективным, и это позволяет избежать воздействия на клетки магнитного колонку и антитела, таким образом уменьшая вероятность активации нейтрофилов.

В дополнение к выполнению функциональных исследований изолированной neutrophшек исключая виво и приемных передачи клеток в мышей-реципиентов, этот протокол также описывает способ маркировки изолированных нейтрофилов с использованием различных красителей CellTracker. Дифференциальный маркировки нейтрофилов у мышей различных генетических фоны могут быть адаптированы в конкурентных исследований репопуляцию для отслеживания переданных нейтрофилов в тканях мышей-реципиентов с использованием проточной цитометрии, которые могут обеспечить механистической представление о непосредственной роли определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в целевые воспаленных органов ^6.