العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني
Summary
نحن تصف بروتوكول لعزل وتنقية العدلات من نخاع العظم الماوس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة والعدلة لوضع العلامات باستخدام الأصباغ CellTracker. وهذا يمثل طريقة بسيطة وسريعة واستنساخه واقتصادية من أجل الحصول على أعداد كبيرة من العدلات للدراسات وظيفية المصب أو نقل وتتبع التجارب بالتبني.
Abstract
العدلات هي خلايا المستجيب الحرجة من نظام المناعة الفطرية. يتم تجنيدهم بسرعة في مواقع الالتهاب الحاد وبذل آثار وقائية أو المسببة للأمراض اعتمادا على الوسط التهابات. ومع ذلك، على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في الحصانة، فهم مفصل من العوامل الجزيئية التي تتوسط الآثار العدلات 'المستجيب وimmunopathogenic في الأمراض المعدية المختلفة والحالات الالتهابية لا يزال غير موجود، وذلك جزئيا بسبب وضعهم قصيرة نصف الحياة، وصعوبات في التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق بها للحصول على أعداد كافية من العدلات للدراسات وظيفية المصب وتجارب نقل بالتبني. ولذلك، طرق بسيطة وسريعة واقتصادية وموثوق بها، مطلوبة بكثرة لحصاد أعداد كافية من العدلات الماوس لتقييم وظائف مثل البلعمة والقتل، خلوى الإنتاج، وتحبب والاتجار بها. وتحقيقا لهذه الغاية،نقدم كثافة بروتوكول التدرج استنساخه القائم على الطرد المركزي، والتي يمكن تكييفها في أي مختبر لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وقدرتها على البقاء. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم بروتوكول بسيط يستخدم الأصباغ CellTracker لتسمية العدلات المعزولة، والتي يمكن بعد ذلك يتم نقل adoptively في الفئران المتلقية وتعقبها في العديد من الأنسجة لمدة 4 ساعة على الأقل بعد النقل باستخدام التدفق الخلوي. باستخدام هذا النهج، ووضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص مع الأصباغ CellTracker مختلفة يمكن استخدامها بنجاح لإجراء دراسات إعادة تعمير تنافسية لتقييم الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الأنسجة المستهدفة في الجسم الحي .
Introduction
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في البشر. هم المكون الرئيسي الخلوية في الجهاز المناعي الفطري ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. المرضى الذين يعانون من قلة العدلات المكتسبة ونقص المناعة الأولية التي تؤثر على أعداد العدلات و / أو وظيفة تطوير التهابات الغازية التي تهدد الحياة البكتيرية والفطرية، وتسليط الضوء على أهمية هذه الخلايا في الدفاع المضيف 1. الاعتراف المناعي للغزو مسببات الأمراض في موقع الإصابة بهم وما شابه ذلك نمط الاعتراف مستقبلات النتائج في الاستقراء لمدبرة الاستجابة المناعية الفطرية، الأمر الذي يؤدي إلى إفراز chemoattractants التي تولد التدرج الكيميائي قادرة على تجنيد العدلات من مجرى الدم إلى الأنسجة الملتهبة 2 . بعد العدلات دخول موقع الإصابة، فإنها تصبح تفعيلها، الأمر الذي يؤدي إلى خلوى وchemokine الإنتاج، وامتصاص الممرض، وقتل عن طريق الأكسدة وغير المؤكسدة ليchanisms 3. وإلى جانب دورها المعترف بها بشكل جيد في المناعة الفطرية، كما تم مؤخرا أظهرت العدلات للعب أدوار هامة مثل المبادرين من الاستجابات المناعية التكيفية فعالة 4. من ناحية أخرى، وبصرف النظر عن الأدوار وقائي بهم في الحصانة، العدلات قد توسط أيضا إصابة الأنسجة والباثولوجيا المناعية بسبب التراكم المفرط و / أو التنشيط في مواقع الالتهاب، كما هو مبين في مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية والمناعة الذاتية 5-7.
على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في تصاعد الاستجابات المناعية الفطرية الفعالة ووظائفها المستجيب عديد المظاهر في العديد من الأمراض المعدية والالتهابات، والصعوبات التقنية مع التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق أعاق البحوث مع العدلات على مدى العقود الماضية. ولذلك، واستخدام المقايسات استنساخه لعزل العدلات ينبغي أن تسهل إجراء المزيد من البحوث على immunolo العدلات بوساطةوظائف gical خارج الحي والحية. حتى الآن، وقد وصفت عدة طرق لعزل العدلات مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة من الدم البشري والدم الماوس أو نخاع العظم 8،9، إيجابية أو سلبية تخصيب immunomagnetic من العدلات من الدم أو نخاع العظم الماوس 10،11، والحصاد من العدلات من التجويف البريتوني من الفئران بعد الحقن داخل الصفاق من thioglycollate أو وكلاء الالتهابية الأخرى 12. على الرغم من العدلات يمكن عزلها بسهولة في أعداد كبيرة من الدم البشري، وهذا الأسلوب هو الأمثل في الفئران نظرا لمحدودية حجم الدم الماوس يحول دون العزلة من العدلات كافية للدراسات وظيفية أو تجارب نقل بالتبني 13. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العائد من thioglycollate-أثارت الخلايا من التجويف البريتوني هو أكبر مقارنة بما كان عليه من الدم الماوس، ونقاء من العدلات في غسيل البريتوني التهابات يختلف بين60-90٪، والعدلات معزولة يحمل النمط الظاهري تفعيلها. وهكذا، جمع الخلايا باستخدام هذا الأسلوب يمكن فقط أن تستخدم لإجراء الدراسات الفنية للتنشيط ولكن ليس من العدلات unstimulated، كما التجويف البريتوني الماوس لديها عدد قليل العدلات في حالة مستقرة 12. بدلا من ذلك، نخاع العظم هو خزان مريحة للحصاد أعداد كبيرة من العدلات إما unstimulated أو تنشيط 11،14، والتي يمكن ان تستخدم بعد ذلك لدراسات وظيفية المصب مثل البلعمة والقتل وتحبب، أو لنقل بالتبني في الفئران المتلقية.
هنا نحن تصف بسيطة وسريعة (~ 2 ساعة) البروتوكول، الذي يوفر العائد المرتفع (~ 6-12 × 10 6 العدلات / الماوس غير مصاب، أو ما يصل إلى 30-40 × 10 6 العدلات / فأر مصاب) من الذهب الخالص (80 -95٪) العدلات مع> 95٪ الجدوى من نخاع العظام. يستخدم هذا الأسلوب Histopaque المتاحة تجاريا، والتي هي كثافة التدرج سيبا الخليةوسائل الاعلام التموينية تتألف من Ficoll ودياتريزوات الصوديوم، لفصل العدلات من نخاع العظام من الفئران. هذه الطريقة تعطي أرقام أكبر بكثير من العدلات في الماوس مقارنة مع الدم أو البريتوني تجويف، فإنه يمكن استخدامها لجمع العدلات من الفئران سواء في حالة مستقرة أو بعد الإصابة، وأنه من الأسهل أن طبقة بالمقارنة مع أسلوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة التي تستخدم متقطع التدرجات Percoll تتألف من 55٪ / 65٪ / 75٪ Percoll في برنامج تلفزيوني 9. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تناقص الوقت والموارد اللازمة لجمع العدلات نقية بشكل ملحوظ مقارنة مع العزلة العدلة باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا. أيضا، لأن هذا الأسلوب لا ينطوي على خطوة تخصيب immunomagnetic، هو أكثر فعالية من حيث التكلفة، وأنه يتجنب التعرض الخلايا إلى العمود المغناطيسي والأجسام المضادة، مما يخفض من احتمال تفعيل العدلات.
بالإضافة إلى إجراء الدراسات الفنية للneutroph معزولةILS خارج الحي ونقل بالتبني من الخلايا في الفئران المتلقية، ويصف هذا البروتوكول أيضا طريقة لوصفها من العدلات المعزولة باستخدام الأصباغ CellTracker مختلفة. وضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من مختلف الخلفيات الوراثية يمكن تكييفها في دراسات إعادة تعمير تنافسية لتتبع العدلات نقل في أنسجة الفئران المتلقي باستخدام التدفق الخلوي، والتي يمكن أن توفر البصيرة الآلي على الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الهدف أجهزة ملتهبة 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم بروتوكول موثوق بها، بسيطة، سريعة واقتصادية لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وجدوى استخدام نهج الطرد المركزي المتدرج الكثافة. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، يمكن استردادها ~ 6-12 × 10 6 العدلات من الماوس المعاف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل شعبة بحوث جماعية من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID)، المعهد الوطني للصحة (NIH)، الولايات المتحدة الأمريكية.
تم الحفاظ على جميع الفئران في رابطة الأمريكية لاعتماد المختبرات العناية المعتمدة مرفق الحيوان الحيوان في المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) ويضم وفقا للإجراءات المبينة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية تحت رعاية بروتوكول التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام من المعدية.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
- Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
- Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
- Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
- Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
- Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).
- Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
- Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
- Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
- Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).
