نحن تصف طريقة لتخميل سطح الزجاج باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG). هذا البروتوكول يشمل تنظيف السطح، functionalization السطح، وPEG الطلاء. ونحن نقدم استراتيجية جديدة لعلاج السطح مع الجزيئات PEG على جولتين، والتي ينتج نوعية متفوقة من التخميل بالمقارنة مع الطرق القائمة.
وقد ثبت جزيء واحد مضان الطيفي ليكون مفيدا في فهم مجموعة واسعة من الظواهر البيولوجية في النانومترية الحجم. أمثلة هامة لما يمكن أن تسفر هذه التقنية إلى العلوم البيولوجية هي رؤى الآلية على البروتين البروتين والحمض النووي البروتين التفاعلات. عندما يتم بحثها تفاعلات البروتينات في مستوى واحد جزيء، كثيرا ما يجمد البروتينات أو ركائز على سطح الزجاج، والذي يسمح لمراقبة طويلة الأجل. هذا المخطط الشلل قد يعرض القطع الأثرية السطح غير المرغوب فيها. وبالتالي، فمن الضروري إيقاف فاعلية سطح الزجاج لجعلها خاملة. طلاء السطح باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) تبرز لأداء عالية في منع البروتينات من التفاعل غير تحديدا مع سطح الزجاج. ومع ذلك، فإن الإجراء طلاء البوليمر أمر صعب، بسبب المضاعفات الناجمة عن سلسلة من المعالجات السطحية والمتطلبات الصارمة التي تحتاج الى السطح لأن تكون خالية من أي جزيئات الفلورسنت في نهاية الإجراء. هنا، ونحن نقدم بروتوكول قوية مع خطوة بخطوة التعليمات. وهو يغطي تنظيف السطح بما في ذلك النقش سمكة البيرانا، functionalization السطح مع مجموعات أمين، وأخيرا PEG الطلاء. للحصول على كثافة عالية من طبقة PEG، ونحن نقدم استراتيجية جديدة لعلاج السطح مع الجزيئات PEG على جولتين، مما يحسن بشكل ملحوظ نوعية التخميل. نحن نقدم نتائج ممثل وكذلك نصائح عملية لكل خطوة حاسمة بحيث يمكن لأي شخص تحقيق جودة عالية التخميل السطح.
عند إجراء دراسة واحدة جزيء البروتين الضروري لتحقيق نوعية عالية من التخميل السطح بحيث التجربة خالية من أي الناجم عن سطح البروتين عطل أو تمسخ 1،2. في حين أن سطح الزجاج تعامل مع السطحي، مثل ألبومين المصل البقري، ويستخدم عادة لواحدة جزيء الحمض النووي الدراسات 3، ودرجة التخميل ليست عالية بما فيه الكفاية لدراسات البروتين. سطح الزجاج المطلي مع البوليمر (غليكول البولي إثيلين، PEG) متفوقة في الأداء التخميل 4-6. وبالتالي، فقد أصبح يستخدم عالميا لدراسات البروتين جزيء واحد من أي وقت مضى منذ أن تم عرضه لدراسة مضان واحدة جزيء 7-10. يتطلب إجراء طلاء البوليمر المعالجات السطحية متعددة 7،11،12. وبالتالي، فمن الصعب اتباع الإجراء بأكمله دون تعليمات مفصلة. في كثير من الأحيان درجة التخميل السطح يختلف اعتمادا على البروتوكول الأوليتبع ق. هنا نقدم بروتوكول قوية مع خطوة بخطوة التعليمات، التي من شأنها إزالة واحدة من العقبات الرئيسية لدراسات البروتين جزيء واحد. انظر الشكل 1 لمحة عامة.
خطوات حاسمة في هذا البروتوكول
فمن الضروري لجعل ماء السطح قبل رد الفعل الأمينية silanization. وقد تحقق ذلك من خلال النقش الذي يولد سمكة البيرانا مجموعات الهيدروكسيل الحرة على سطح الزجاج / الكوارتز. فمن المستحسن عدم الحفاظ على سطح محفورا سمكة البيرانا يتعرض إما H 2 O أو الهواء لفترة طويلة من الزمن منذ hydrophilicity من السطح وتنخفض تدريجيا.
جزيئات NHS استر PEG هي رد الفعل. ينصح لجعل مأخوذة وتخزينها تحت النيتروجين في -20 درجة مئوية. حياة الرف المادة الكيميائية APTES في درجة حرارة الغرفة قصيرة. ينصح ليحل محله مع واحدة جديدة كل شهر.
إدخال تعديلات على هذا البروتوكول
عندما لا يمكنك استخدام الحفر سمكة البيرانا لأي سبب من الأسباب العملية، قد حفر باستخدام KOH لفترة طويلة من الزمن (مثل سvernight)، الأمر الذي سيجعل أيضا مجموعات الهيدروكسيل عرضة للخطر. في شرك هذا النهج البديل هو أن يصبح غير قابل للاستخدام الشريحة بعد عدة بتدوير بسبب الخدوش شديدة.
وغالبا ما تمارس لحرق سطح الزجاج / الكوارتز باستخدام الشعلة البروبان، وهو فعال في القضاء على المواد العضوية الفلورسنت 7. لم يتم تضمين هذا الإجراء في هذا البروتوكول لأنه لا لزوم لالنقش سمكة البيرانا. لاحظ أن هذا الإجراء سوف تؤدي إلى أكسدة مجموعات الهيدروكسيل. لذلك، لا ينبغي أن يتم هذا الإجراء مرة واحدة كان محفورا على السطح باستخدام KOH أو حل سمكة البيرانا.
عند استخدام العازلة مع الرقم الهيدروجيني أقل من 7 لتصوير واحدة جزيء، والتشكل من PEG يتغير من "الفطر" إلى "فرشاة"، مما يقلل من درجة التخميل. لذلك، عندما يتم استخدام الرقم الهيدروجيني أقل من 7.0، فمن المستحسن لمزيد إيقاف فاعلية السطح باستخدام disuccinimidyl tartarate <سوب> 7.
وجهات نظر
وقد قدمت هذا العمل بروتوكول قوية لتحقيق جودة عالية التخميل السطح. وهذا البروتوكول يكون من المفيد للدراسات مضان واحدة جزيء التي تشارك مع البروتينات 14 وكذلك المجمعات البروتين داخل الخلايا ومقتطفات immunoprecipitates 15. سيتم استخدامه على نطاق واسع لغيرها من تقنيات جزيء واحد مثل التحليل الطيفي القوة وعزم الدوران الطيفي 16. وسوف يكون من المفيد أيضا لمنع الخلايا من التكثيف على السطح 17.
بروتوكول المنصوص عليه في هذا العمل وتطالب لإجراءات متعددة الخطوات الخاصة به. التخميل السطح باستخدام الدهون PEG-8 وبولي يسين PEG 9 تتوفر كنهج بديل. منذ ذلك الحين، أنها لا تتطلب أي التفاعلات الكيميائية فمن السهل لتنفيذ. ومع ذلك، فإن درجة التخميل ليست عالية كما أن يتحقق من خلال modif الكيميائيةication من السطح.
The authors have nothing to disclose.
وتم دعم مركز إيداع الأوراق المالية، منظمة العمل ضد الجوع، وCJ بواسطة بدءا المنح (ERC-جنيها استرلينيا-2012-309509) من خلال مجلس البحوث الأوروبي. وأيد J.-MN من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث (جبهة الخلاص الوطني) (2011-0018198) كوريا؛ وبرنامج مركز البحوث بايونير (2012-009586) من خلال جبهة الخلاص الوطني من كوريا بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتخطيط المستقبلي (MSIP). وأيد هذا العمل أيضا من قبل مركز BioNano الصحية الممولة من قبل الحرس MSIP كوريا باسم مشروع الحدود العالمية (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). وتم دعم YKL وJ.-HH من قبل برنامج زمالة العلوم سيول مدينة سيول، كوريا. كان البروتين المسمى معدل تقييم هدية سخية من الدكتور سوا ميونغ.
1. Slide preparation and cleaning | |||
Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24x32mm2, 22x40mm2, 24x50mm2 (No.1½, Rectangular) |
Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
H2O2 | Boom | 6233905 | Opened bottles should be stored at 4 °C. 1 L, hydrogen peroxide 30% |
H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
2. Coverslip cleaning | |||
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 3-aminopropyl trimethoxysilane |
Flask (200mL) | VWR | Flask (200 mL) | Have one flask dedicated for aminosilanization. Pyrex flask |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da |
mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
6. Surface passivation (the second round) | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
MS4-PEG | Pierce | 22341 | Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 °C. Short NHS-ester PEG, MW 333 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
7. Assembling a microfluidic chamber | |||
Double sticky tape | Scotch | 10mm wide | |
Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
Neutravidin | Pierce | 31000 | Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 °C. ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein |
Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 °C. |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |