Нецелевые Метаболомики из биологических источников Использование UltraPerformance жидкостной хроматографии высокого разрешения масс-спектрометрии (UPLC-HRMS)
Summary
Нецелевые метаболомика предоставляет гипотезы генерации снимок метаболический профиль. Этот протокол будет продемонстрировать выделения и анализа метаболитов из клетки, сыворотка, или ткани. Целый ряд метаболитов опрошенных с использованием жидкостной экстракции жидкой фазы, микропотока UltraPerformance жидкостной хроматографии / высокое разрешение масс-спектрометрии (UPLC-HRMS), соединенный с дифференциальным программного обеспечения для анализа.
Abstract
Здесь мы представляем рабочий процесс для анализа метаболических профилей для биологических образцов, представляющих интерес, включая, клетки, сыворотка, или ткани. Образец сначала разделяют на полярных и неполярных фракций путем жидкостно-жидкостной экстракции, и частично очищенный для облегчения ниже анализа. Обе водные (полярные метаболиты) и органические (неполярные метаболитов) фазы первоначальной экстракции обрабатываются для обследования широкого спектра метаболитов. Метаболиты отделены друг от различных методов жидкостной хроматографии на основе их свойств раздела. В этом методе, приведем микропотоке ультра-производительность (UP) LC методы, но протокол является масштабируемой более высоких потоков и низком давлении. Введение в масс-спектрометр может быть достигнуто путем общего или соединение оптимизированных условиях источника. Обнаружение широкого спектра ионов осуществляется в режиме полного сканирования как положительные, так и отрицательные режиме в широком м / з диапазон при высоком разрешении на недавно Calibrated инструмента. Без наклеек дифференциальный анализ осуществляется на платформах биоинформатики. Применение этого подхода включают метаболические пути скрининга, биомаркеров и разработки лекарственных препаратов.
Introduction
В связи с последними технологическими достижениями в области HRMS, нецелевого, гипотезу генерирующих метаболомика подходы стали осуществимый подход к анализу сложных образцов. 1 Масс-спектрометры, способные 100000 резолюцию облегчения рутинной нижней части на миллион (промилле) масса точности стали широко доступны от различных поставщиков. 2,3 Эта масса точность позволяет более конкретно и уверенность в проведении предварительных работ анализируемого идентичности, изотопного распознавания образов, и аддукт идентификации. 4 В сочетании с соответствующей процедурой добычи и высокопроизводительных LC или UPLC, сложных смесей могут быть проанализированы с дополнительной спецификой, полученные из данных времени удерживания. 5 UPLC обладает большей эффективностью и хроматографические обеспечивает большую чувствительность, разрешение и анализ времени, делая более широкий охват метаболом возможно. 6 Полученные больших объемов данных может быть интегрирован в любоймножественных программного обеспечения для анализа дифференциальных и добывают на полезную модель или отдельных интерес аналитов. 7,8,9,10,11 Предполагаемые хитов может быть первоначально определены с использованием комбинации пик алгоритмов обнаружения, точное предсказание на основе массы химической формулой, фрагментация предсказания, и химические поиска в базах данных. Такой подход позволяет приоритетных целей для трудоемких полной структурной идентификации или в целях развития более чувствительными и более конкретные стабильной изотопного разбавления UPLC / или несколько выбранных для мониторинга реакций / MS исследований, которые в настоящее время являются золотым стандартом методы количественной оценки. 12
Различной природы биологических образцов привело к оптимизации добычи протоколы для мочи 13, 14 клетки, сыворотка 15 или ткань 16. Этот протокол экстракции функции для клетки, сыворотка, и ткани. В случае необходимости, замечания и дополнительные ссылки были включены для модификацииных процедуру для решения включения стабильных изотопов, а также для включения особенно нестабильный метаболитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нецелевые метаболомика предлагает мощный инструмент для исследования или эндогенных ксенобиотиков биотрансформациях, или захвата метаболический профиль из образца интерес. Выход техники весы с разрешением и чувствительностью от технологии, используемой для разделения и анализа об…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем поддержке грантов NIH P30ES013508 и 5T32GM008076. Мы также благодарим Thermo Scientific для доступа к SIEVE 2.0 и доктора. Евгений Ciccimaro и Марк Сандерс Thermo Scientific за полезные обсуждения.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
