사용<em> 생체 내</em> 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수
Summary
신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 – 동물의 적응<em> 생체 내</em> 이미징 루시 페라 제 – 재조합 바이러스에 감염된 신생아의 시간 코스 분석을 수행 할 수 있습니다.
Abstract
인간 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV 또는 HHV-5) 면역 손상 개인의 생명을 위협하는 병원체이다. 선천성 또는 신생아 감염되면, 바이러스는 감염 및 청각 장애, 정신 지체 등 심각한 신경 손상을 야기 할 수 두뇌 개발에 복제합니다. 증상의 잠재적 인 심각성에도 불구하고, 치료 옵션이 백신은 특정 바이러스 치료의 부재의 가용성에 의해 제한됩니다. 관찰은 주로 감염된 아이의 부검에서 파생 있기 때문에 또한, 중추 신경계 (CNS)의 감염 중에 발생하는 분자 사건의 정확한 설명은 아직 부족하다. 같은 붉은 털 원숭이 짧은 꼬리 원숭이 CMV 등 여러 동물 모델, CNS에서 CMV의 병인으로 발전하고 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그러나 인간과 진화의 근접에도 불구하고,이 모델은 동물과 단점을 감염하는 데 사용되는 두개 접종 절차에 의해 제한되었다istently CNS 감염을 유도. 또한, 윤리적 마우스 사이토 메갈로 바이러스 (MCMV) 신생아 생쥐의 신생아 감염이 최근 크게 발전하게되었다 그중, 다른 모델의 개발을 추진하고있다. 예를 들어, 그것은 글루 Balb / C 신생아에 MCMV의 복강 내 주입은 뇌의 특정 영역에있는 뉴런과 glial 세포의 감염에 이르게 것을보고 하였다. 이러한 연구 결과는 생쥐의 실험 접종은 어린이 HCMV 감염에 의해 유발 적자를 요점을 되풀이 할 수 있다고 제안했다. 그럼에도 불구하고, 신생아의 MCMV 감염의 동적 분석은 고전적인 방법은 바이러스 성 부담 및 / 또는 면역 관련 매개 변수를 분석하는 서로 다른 시간 지점에서 동물의 상당수의 희생을 필요로하기 때문에 수행하기가 어렵습니다. 이 병목 현상을 회피하고 희귀 한 돌연변이 동물의 향후 조사를 가능하게하기 위해, 우리는 비라의 시간 코스 분석을 수행하기 위해 생체 내 이미징 기술 적용C57BL / 6 신생아에 루시 페라 제 표현하는 재조합 MCMV의 말초 주입시 뇌의 L 보급.
Introduction
인간 거대 세포 바이러스 (HCMV/HHV-5)는 β-헤르페스 가족의 구성원입니다. HCMV는 일반적으로 무증상 감염이 1로 초기 생활하는 동안 획득 매우 유행, 기회 병원균이다. 모든 헤르페스 바이러스와 마찬가지로, HCMV는 면역 체계를 단단히 바이러스 복제를 제어하는 호스트의 전체 수명 동안 지속됩니다. 바이러스 재 활성화의 에피소드는 대부분 같은 이식 거부 2을 방지하기 위해 약물을받는 이식 환자와 같은 면역 개인에서 발생합니다. 성인, HCMV는 교종 3에 연결되어 있습니다. 또한, HCMV는 미성숙 한 면역 4-6 신생아 눈에 띄는 병원체이다. 개발 태아 또는 신생아의 주 감염은 심각한 결과를 가질 수 있습니다. HCMV 감염은 선진국의 선천적 결함과 어린 시절 장애의 가장 흔한 감염 원인입니다. 그것은 신생아 HCMV 감염의 빈도는 0.5 % O에 영향을 미치는 것으로 추정된다F ~ 10 %가 같은 소두증 또는 소뇌 형성 부전 등의 심각한 증상으로 고생되는 가운데 모든 출산. 또한, 무증상 바이러스 감염에 감염된 유아의 10 %는 나중에 손실, 시각적 결함이나 발작과 간질 7,8 청각, 정신 지체로 이어지는 sequellae을 개발합니다.
로 주입 9 다른 경로를 통해 마우스에 접종 할 수있는 등 단순 포진 1 (HSV-1/HHV-1)와 같은 다른 인간 헤르페스 바이러스에 반대, 사이토 메갈로 바이러스 복제는 특정 종이다. 이 기능은 심각하게 다른 동물 모델에서 수행되는 HCMV의 발병의 조사를 방해 (마우스, 쥐, 기니피그, 붉은 털 원숭이)과 각각의 정품 호스트 관련 CMVs있다. 모든 CMVs 게놈의 크기 및 조직, 조직 친 화성 및 유전자 발현의 조절에 상당한 유사성을 나타냅니다. 또한 각각의 호스트에있는 유사한 병리를 유발. 에도 불구하고 게놈 다양성은 수사이 HCMV 및 마우스 사이토 메갈로 바이러스 (MCMV) (ORF를 50 % 쥐 CMV에서 확인 된 인간의 바이러스에 존재)는 마우스 모델은 최근 대부분의 돌연변이 변종이 바이러스를 통제 할 수있는 능력을 테스트 할 수 있기 때문에 유리한 것으로 판명되었습니다 생체 내에서 복제. 이것은이 바이러스 10 "resistome"를 구성하는 성인 무대에서 표현 마우스 유전자의 수의 추정을 가능하게 유전 화면되었다. 모두이는 MCMV에 감염된 생쥐는 성인의 호스트 바이러스 상호 작용의 연구를위한 매력적인 모델을 나타냅니다 나타냅니다. 인간과 생쥐 사이의 태반 층 조직의 차이가 생쥐의 바이러스 감염의 어머니에 태아 전송을 방해하기 때문에 선천성 CMV 감염의 탐험은 더 복잡합니다. 최근 임신 일 12.5에 태반 MCMV 직접 주입 장애 11 청각을 주도 쥐 신생아의 뇌 감염을 가능하게했다. 그러나 대부분의 전nvestigations 지금 잠재적으로 혈행 뇌 감염으로 이어지는 조직의 바이러스 전파, 두개 내 주사보다 더 관련이 모델을 제공하는 4-20 시간 된 신생아의 복강 내 주사를 사용합니다. 이 프로토콜은 CMV의 병인에 중요한 통찰력을 제공하고 특히, 그것은 대식 세포 12와 같은 단핵 세포에 침투하는 염증 병소에있는 신경 세포와 아교 세포에서 바이러스 복제 신생아 결과의 MCMV 감염을 증명 하였다. 이 보고서는 또한 감소 과립 신경 세포의 증식과 이동 및 여러 인터페론 – 자극 유전자의 유도와 함께 소뇌의 변경 형태 형성을 설명했다. 중추 신경계 MCMV의 컨트롤에 대한 CD8 + T 세포의 중요한 역할은 같은 그룹 (13)에 의해보고되었다. 미생물의 병적 인 효과를 분석 할 때 고려해야 할 중요한 측면은 감염의 역학이다이온. MCMV의 경우는 미래 신경 생물학적 손상의 정도를 이해하고 예측하기 위해 개발 뇌에 바이러스 전파의 진행을 탐구하고 정량화하는 것이 특히 중요합니다. 전통적으로, 감염의 진행의 정량화는 감염된 동물의 정기적 인 희생 액세스 할 수없는 두뇌와 같은 조직에 병원체, 역가 필요합니다. 프로토콜 유형은 지금 필요한 동물 복지의 향상과 3RS (교체, 수정, 감소) 원리 (14)에 의해 도전을하고 있습니다. 생체 내 이미징 기술을 사용하여 생체 내 감염 실험에 필요한 동물의 수의 급격한 감소를 허용 할 수 있습니다. 여기, 우리는보고와 마우스 신생아에 복강 MCMV 룩 주입시 뇌에 바이러스 전파의 시간 코스 분석을 설명합니다. 같은 동물을 사용하여, 우리는 강렬한 VI의 사이트를 추적하고 생체 모니터링2 주 기간 동안 RAL 복제.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 신생아 MCMV 룩 보급을 모니터링하는 생체 이미징 기술을 사용하여, 우리는 야생형에 반대 돌연변이 동물의 뇌에 바이러스 확산을 관찰 할 수 있었다. 뇌의 동물과 생체 이미징의 추가 해부 중추 신경계의 발광 바이러스의 존재를 확인했다. 또한, 우리는 또한 MCMV E1 초기 단백질에 대한 특정 항체를 뇌의 얇은 부분에 (미도시) 면역 조직 화학 염색을 시행하고 실제로 MCMV?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 바이러스학 연구소의 동물 시설을 사용할 수있는 권한을 증폭 및 MCMV – 루크와 토마스 Baumert (INSERM U748, 스트라스부르) 적정에 대한 리 Tuddenham (IBMC, 스트라스부르) 감사합니다. INSERM, Université 드 스트라스부르과 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR-08-풍채 005 01)로부터 재정 지원을 인정 받고 있습니다. 자신의 마스터 프로젝트 기간 동안 소니아 Beroud 및 Laetitia Lelieur의 초기 참여도 인정 받고 있습니다.
Materials
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
References
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