臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

1。臍帯血から単核細胞の単離 95ミリリットルすすぎバッファ（1:20希釈）にEDTA-PBS緩衝-addを5ミリリットルウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液を調製します。ドガバッファと氷の上でバッファを保つ重要：気泡が分離カラムをブロックする可能性があるため、CD19 + B細胞を単離する際に脱気に失敗すると、バッファが最適な結果未満になることがあります。 密度勾配遠心法を50mlコニカルチューブを準備します。臍帯血を処理するために必要な管の数（1管は8ミリリットルの血液を処理することができます）を決定し、各チューブへのFicoll-Paque PLUSの15ミリリットルを追加します。 24ミリリットルのDPBS（1X）と​​臍帯血の8ミリリットルを希釈し、慎重に50 mlコニカルチューブの各々でのFicoll-Paque PLUSの上の層薄めた臍帯血の混合物を。血液とのFicoll-Paque PLUSを混ぜて使用しないでください重要：臍帯血とのFicoll-Paque PLUSの混合を避けるために、45度の角度でチューブを保持し、層血液混合物にゆっくりと。 20℃で40分間、400×gで遠心分離し、単核細胞（MNC）はプラズマのFicoll-Paque PLUSのFicoll-Paque PLUSの浸透圧で高密度に堆積物による顆粒球や赤血球に対しインターフェースのままになります。サンプルID、日付、次のとパート3で使用されるラベル7 5ミリリットル丸底チューブ： チューブ ラベル 目的 1 染色されていないフローサイトメトリーの間に正規化のための非染色細胞 2 7AAD フローサイトメトリーの間に生存率を決定するために、 3 + + + + ソートされた細胞が含まれています 4 34 + CD34 + / CD19を収集するには+（後期プロB – 早期プレBI）の細胞 5 低い 45 低 / CD19 + / CD45（プレBI）の細胞- CD34を収集するには 6 45 MED / CD19 + / CD45 MED（プレBⅡ） -細胞CD34を収集するには 7 高さ 45 / CD19 + / CD45 高 （未熟B）細胞- CD34を収集するにはコー​​トチューブ4、5、6、2％FBSを含む7と氷の上で全てのチューブを配置します。 慎重に上部の血漿層を吸引除去し、単核細胞層との接触を避ける。 10ミリリットルガラスピペットを用いて、慎重に新しい50 mlコニカルチューブに単核細胞層を転送します。シングル50 mlチューブに一緒に3つの管から単核細胞を兼ね備えています。 穏やかに混合し、10分間、300×gで遠心分離し、PBSでチューブを埋める20℃慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。 1xを繰り返します。最初の洗浄後、ペレットを再懸濁し、単一の50 mlコニカルチューブに移す。 穏やかに200μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁します。 、細胞懸濁液の1μlを取り外し1.5 mlマイクロチューブに1mlのPBSに追加して（遠心機で50mlの細胞懸濁液を配置した後にセルをカウント）カウントするために脇に置きます。 PBSでチューブを記入し、血小板を除去するために15分間、200×gで遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく、完全に上清を取り除きます。 2。 MACS分離を用いて単核細胞から修正されたB細胞の単離 160μlの冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液でステップ1.7からペレットを再懸濁します。 40μlのB-CLLビオチン抗体カクテルを追加します。 4℃でよく混ぜ、10分間インキュベートしたピペット細胞を洗浄 – 10万セル（セルNU当たり1ミリリットル冷（4℃）、EDTA-PBSバッファー追加mberは、ステップ1.7）で決定し、10分間300×gで遠心分離します。完全に上清を吸引除去し、その後、320μlの冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 80μlの抗ビオチンマイクロビーズを追加し、4℃でよく混ぜ、15分間インキュベート細胞を洗浄 – 10分間、300×gで1 mlの冷（4℃）で10万個の細胞と遠心当たりEDTA-PBSバッファーに追加します。冷（4℃）、EDTA-PBSバッファー500μlに億セルまで再懸濁する。細胞数に応じてスケールバッファ量。 遠心分離（ステップ2.5）中にMACSカラムとMACSセパレータを準備します。 、MACSセパレータの磁場中でのLSカラムを配置するカラムに冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液3mlを加えるとバッファがカラムを垂れることができます。を通る流れをキャッチするためにレセプタクルを使用します。フロースルーを捨てる。 列の下に50 mlコニカルチューブを配置し、カラムに細胞懸濁液をピペット。非標識細胞はthrougドリップすることができますH列及び50 mlコニカルチューブに。重要：これらの抗体標識と細胞選別のために使用される細胞である。フロースルーは捨てないでください。ステップ2.5からの細胞のすべてを回復するには、コニカルチューブの壁に冷（4℃）、EDTA-PBSバッファーの追加の1 mlを加える。静かに混和し、カラムに残っている細胞懸濁液をピペット。 1xを繰り返します。カラムを通過した後、コニカルチューブに収集する非標識細胞を用いて2.8に進みます。 10分間300 xgでPBSおよび遠心分離機で標識されていない細胞を含む円錐管を埋める。慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去する。 EDTA-PBSバッファー200μlを加え、穏やかに細胞を再懸濁します。 3。細胞選別のための抗体標識と準備 （ステップ1.4）、 "染色"というラベルの付いたチューブに細胞懸濁液と場所の1μlを吸引します。 500μlのEDTA-PBSバッファーを加え、チューブを氷上に保存してください。 20を追加残りの細胞懸濁液中に万個の細胞あたりの各抗体液（CD19、CD34およびCD45）。よく混和し、室温で30分間、暗闇の中でチューブを配置します。ライトがオフになっているCD抗体は2-4光感受性、完全な手順は次のとおりです。 抗体とのインキュベーションの30分後、細胞懸濁液40μlを吸引し、 "7AAD"というラベルの付いたチューブに入れます。 2分間、500×gでチューブと遠心分離機に1mlのPBSを追加します。上清を除去し、結合用緩衝液100μlの中に細胞を再懸濁します。 7AADの7μlの（7-Aminoactinomycin D）を追加し、室温で10分間、暗所でインキュベートする。 10分間のインキュベーションの完全なステップ3.4の間。 CDの抗体で標識され、残りの細胞を含むチューブの上部にPBSを追加します。 3分間、500×gでチューブを遠心分離します。上清を除去し、500μlのEDTA-PBSバッファーを添加し、細胞ペレットを再懸濁します。 "+ + +"というラベルの付いたチューブに細胞懸濁液の全量を移す。細胞懸濁液の全てを回復するには"+ + +"というラベルの付いたチューブに50 mlコニカルチューブおよび転送するためには、ddには、追加の1ミリリットルEDTA-PBSバッファー。 インキュベーション後（ステップ3.3）、7AADチューブに300μlの結合バッファーを加える。 "染色"、 "7AAD"や"+ + +"サンプルと"34 +"、 " 低 45"、 "45 MED"と"45 高い "チューブは、フローサイトメトリーのための準備が整いました。 4。 MoFloのXDPフローサイトメーターを用いて細胞ソーティングソート用MoFloアップセット：レーザーの位置を合わせ、液滴の流れを安定させる、廃棄遅延を決定する。 製造元の指示に従って、インビトロジェンABCマウスビーズキット（あるいは同様のもの）を使用して、単一の色補正コントロールを準備します。正と負の集団の最適な分離のための蛍光チャンネルの電圧を調整して、単一のカラーコントロールを実行します。補正係数を設定し、収集プロトコルに補正パラメータを適用します。再確立補償係数抗体の新しいロットが得られるたびに。 図2に示すように、プロットなどのプロトコルを作成します。 前方および側方散乱のために染色されていないサンプル、セット電圧とゲインを実行して、負の蛍光集団を同定する。 DNAの回収は、ソートの目標であるため、しきい値が低く設定されるべきです（≤1％）ので、DNA含有破片は回収試料を汚染しない。 *エアゾール避難システムは、人間の細胞がMoFlo上で実行されている生きているすべての回で実行されていることを確認します。 ゲーティング戦略（ 図2）を設定するには、+ + +のサンプル（〜50,000イベント）の小アリコートを実行します。 B細胞の前駆細胞が成熟B細胞と同様に散布しないため、リンパ球ゲートは、潜在的なプロB細胞を含むことを確認するために、+ / CD34 +集団SSC対FSCのプロット上にゲートなしCD19をバックゲート。このサンプルからも7AADで負の蛍光人口を設定します。 サンプルの実行可能性を判断するために7AADサンプルを実行します。で高生存率を有する試料からの種の細胞のみ死んだ細胞のように冒頭（≥95％）が無差別に染色するとソート集団を汚染する可能性がある。 4つの集団を収集するためにソートの決定を設定します。CD19 + / CD34 +、CD19 + / CD34 – / CD45 低い ; CD19 + / CD34 – / CD45 MED、およびCD19 + / CD34 -ハイ / CD45。すべての集団の一種の意思決定におけるリンパ球とダブレット判別ゲートを含む。 ソーティングチップに目詰まりを防止するために、フィルタ+ +任意の集約は、ソート中に試料中に発生した場合に、ソートや再フィルタ直前40μmのセルストレーナーを通して+サンプル。 冷却または氷パックチューブホルダーにPBS中2％FBSで被覆された採血管（ステップ1.4）に細胞をソートします。 ソートが完了した直後には、DNAを抽出する。