الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس
Summary
مع صغر الجسم التشريح العصبي شفافة موثقة جيدا، ومجموعة من التقنيات الجينية قابلة والكواشف،<em> C. ايليجانس</em> يجعل الكائن الحي النموذج المثالي لل<em> في الجسم الحي</em> التصوير باستخدام الخلايا العصبية بسيطة نسبيا، وانخفاض التكلفة التقنيات. نحن هنا وصف واحد التصوير داخل الخلايا العصبية سليمة باستخدام الحيوانات البالغة المشفرة وراثيا مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت.
Abstract
والديدان الخيطية دودة C. ايليجانس هو كائن النموذج المثالي لبسيطة نسبيا، والتصوير بتكلفة منخفضة الخلايا العصبية في الجسم الحي. جسمها شفافة صغيرة وبسيطة وجيدة تتسم الجهاز العصبي يسمح بتحديد والتصوير مضان من الخلايا العصبية داخل أي الحيوان سليمة. تقنيات بسيطة الشلل مع تأثير ضئيل على علم وظائف الأعضاء في الحيوان السماح الممتدة الوقت الفاصل بين التصوير. تطوير fluorophores الكالسيوم وراثيا ترميز حساسة مثل cameleon 1 و 2 تسمح GCaMP في التصوير المجراة من الكالسيوم العصبية تتعلق بكل علم وظائف الأعضاء والخلايا نشاط الخلايا العصبية. سلالات معدلة وراثيا معربا عن العديد من هذه الخلايا العصبية في fluorophores محددة متوفرة أو يمكن بناؤها باستخدام تقنيات راسخة. هنا، نحن تصف الإجراءات التفصيلية لقياس ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا العصبيه واحدة في الجسم الحي باستخدام كل GCaMP وcameleon. نناقش مزايا وdisadvantالأعمار من كلا فضلا عن أساليب مختلفة لإعداد العينات (تجميد الحيوانات) وتحليل الصور. وأخيرا، فإننا نقدم نتائج تجربتين: 1) عن طريق GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية الحسية لمحددة لمجال كهربائي خارجي و 2) عن طريق cameleon لقياس استجابة الكالسيوم الفسيولوجية للخلية عصبية إلى أضرار الليزر الصدمة. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم مثل هذه على نطاق واسع في C. وقد تم تمديد ايليجانس والقياسات في الحيوانات التحرك بحرية، الخلايا العصبية متعددة في نفس الوقت والمقارنة بين خلفيات وراثية. C. ايليجانس يقدم نظام قوي ومرن لفي الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية مع أنظمة المزايا على نموذج آخر من البساطة الفنية والتكلفة.
Introduction
هنا نقدم طرق عملية لفي الجسم الحي التصوير الكالسيوم في C. الخلايا العصبية ايليجانس. تطوير fluorophores الكالسيوم الحساسة للترميز وراثيا مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية يجعل C. ايليجانس نظام بسيط نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لقياس الفسيولوجيا العصبية والنشاط. ويتم التصوير لدينا مع المجهر المركب باستخدام معيار واسع المجال من التصوير مضان fluorophores المتاحة عموما. نقدم العديد من التقنيات المختلفة التي تستخدم fluorophores والاستعدادات عينة مختلفة، ومناقشة نقاط القوة والضعف لكل منها. وترد البيانات من التجارب ثم المثال الثاني. ويمكن الاطلاع ممتازة من الموارد الإضافية على التقنيات الموضحة هنا في WormBook، "تصوير نشاط الخلايا العصبية والعضلات" من قبل كير R.، ( http://www.wormbook.org ) 3.
فئتين الرئيسية للجينياويشيع استخدام ترميز أتوماتيكيا للصحفيين الفلورسنت الكالسيوم في C. ايليجانس: واحد GCaMP قناة وcameleon الحنق القائم. سنقوم بشرح أساليب وتظهر أمثلة للبيانات التي تم إنشاؤها بواسطة كل منهما.
ويستند GCaMP على بروتين الفلورية الخضراء تعديل (GFP) التي تعتبر حساسة لتركيز الكالسيوم المحيطة بها. ويتم إنجاز هذا عن طريق مزيج من GFP وتقارب الكالسيوم عالية البروتين كالمودولين، على ان يكون ملزما من الكالسيوم عن طريق كالمودولين يرتفع جزيء GFP في تأكيد على كفاءة الفلورسنت 2. التطورات الأخيرة في هذه fluorophores توليد إشارة استثنائية مع زيادة حجم ما يصل الى 500٪ في كثافة مضان على نطاق والفسيولوجية للمستويات الكالسيوم وحركية بسرعة معقولة من 95 مللي ثانية ~ الوقت وارتفاع ~ تسوس ميللي ثانية 650 مرة 4. على مدى فترات زمنية قصيرة نسبيا (دقائق)، يمكن لهذه الإشارات كبيرة تسمح للتصوير دقة أقل (أقل التكبير)، ونظرا لحسن تصرف الحرف الأولالاتحاد العالمي للتعليم قياس خط الأساس، ينفي ضرورة أساسية متصلة أو قياسات نسبية.
Cameleon له ميزة كونه fluorophore الحنق على أساس أن يولد قياس ratiometric المقارنة بين اثنين من قنوات مستقلة أو موجات 1. وهي تتألف من اثنين fluorophores منفصلة (البروتينات الفلورية سماوي والصفراء التي ينبعث منها، وYFP CFP) ويربطها به كالمودولين بروتين. يضيء مجمع مع الضوء الأزرق (440 نانومتر) التي يثير CFP. ملزمة من الكالسيوم يرتفع fluorophores أقرب معا، وزيادة نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) من CFP (المانحة) إلى YFP (متقبل) والتسبب في انبعاث CFP (480 نانومتر) لتقليل الانبعاثات وYFP (535 نانومتر) لزيادة . يتم قياس مستويات الكالسيوم النسبية بأنه نسبة كثافة YFP / CFP. حركية Cameleon تكون أبطأ من تلك التي GCaMP، وتقاس في الجسم الحي لقضاء وقت صعود ثانية 1 ~ وزمن اضمحلال 3 ~ 5 ثوانى. ومع ذلك،نسبة إشارات تتحرك معاكس يزيد من حجم إشارة ويعوض عن عدد من القطع الأثرية ممكن نظرا للتغيرات في حركة fluorophore، أو الانجراف التركيز التركيز والتبييض.
للصحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا ينفي الكثير من إعداد العينات المطلوبة مع تحقيقات تدار خارجيا وC. ايليجانس الجسم شفاف يسمح التصوير داخل صغيرة الحيوان سليمة باستخدام بسيطة مضان حقل واسع. التحدي الرئيسي في إعداد العينات التقنية لذلك لشل حركة الحيوانات بأمان. هناك عدد من التقنيات المختلفة المستخدمة لكل منها مزايا وعيوب. استخدام وكيل الدوائية على شل الحيوانات من السهل لتنفيذ ويسمح للتصاعد من الحيوانات متعددة على واحد إعداد (الليفاميزول، ناهض الكولينية التي تسبب الأنسجة العضلية للاستيلاء وعادة ما تستخدم 6). C. ويمكن أيضا أن يجمد ايليجانس الجسدي من قبل متزايدة منهمعلى تصلب الاغاروز 10٪ 7 و 8. يقلل هذا التأثير على علم وظائف الأعضاء الحيوانية، ويسمح على المدى الطويل التصوير (ساعة) والانتعاش من الحيوانات متعددة ولكن هو أكثر صعوبة من الناحية الفنية. كل من هذه التقنيات تقييد الوصول الفعلي إلى الحيوانات (التي هي تحت الغطاء زلة) وبالتالي يمكن أن تستخدم إلا مع المحفزات التجريبية معينة (مثل الضوء، حقل، ودرجة الحرارة الكهربائية أو تلف ليزر). لالمحفزات التي تتطلب الوصول المادي، مثل اللمس أو إدارة المواد الكيميائية، والعديد من الدراسات لصقها بنجاح C. ايليجانس في مكان (باستخدام الغراء البيطرية الصف) 9. هذا هو أكثر تحديا من الناحية الفنية، هو إعداد حيوان واحد، ولا تسمح الانتعاش الحيوان. وأخيرا، فقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك العديدة التي تقيد جسديا C. ايليجانس، يمكن الحفاظ على فسيولوجيا الحيوان، مما يسمح التعرض لمعظم أنواع المنبهات (اعتمادا على تصميم الجهاز) وتمكين التبادل السريع والتعافي من الحيوانات <sup> 10 و 11. لكن على microfluidics تتطلب مهارات فنية وقدرات إضافية في تصنيع وتصميم وتنفيذ. يمكن في النشاط والتحفيز يجمد الحيوانات عموما يمكن قياس استجابة في الحسية وinterneurons. نشاط الخلايا العصبية الحركية يتطلب تقنيات أكثر تطورا لتصوير الحيوانات في الحركة. هنا سنقدم طرق مفصلة توظيف الطريقتين الأكثر مباشرة من paralyzation الدوائية والشلل مع الاغاروز شديدة.
يمكن استخدام الأساليب المعروضة هنا لقياس نشاط الخلايا العصبية وعلم وظائف الأعضاء في الخلية C. ايليجانس. نعطي مثالا على كل منها: استخدام GCaMP لقياس استجابة الخلايا العصبية الحسية من ASJ إلى حقل كهربائي خارجي، واستخدام cameleon لقياس استجابة الكالسيوم الفسيولوجية للضرر الليزر من الخلايا العصبية. هذه الأمثلة تبين مزايا وعيوب هذين النوعين من fluorophores وتوضيح ما هو ممكن مع النظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم ترميز مؤشرات الكالسيوم وراثيا المستخدمة على نطاق واسع في C. ايليجانس بيولوجيا الأعصاب. استخدمت هذه التقنيات فئات عديدة لدراسة استجابة الخلايا العصبية الحسية الأولية للمؤثرات الخارجية كما هو موضح هنا مع الاستجابة لASJ مجال كهربائي. ومن الأمثلة البارزة الإ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ساهم عدة أشخاص في أعمال وصفها في هذه الورقة. بنيت CVG الإعداد التجريبية، وLS، SHC، وCVG إجراء التجارب. كتب CVG وSHC المخطوطة. جميع المؤلفين شارك بعد ذلك في عملية مراجعة والموافقة على النسخة النهائية من المخطوط. نشكر بول ستيرنبرغ لسلالة GCaMP. وقدمت بعض سلالات النيماتودا المستخدمة في هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC)، الذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). تم تعديل برنامج MATLAB تحليل الصور عن تلك المستخدمة في 18. ويؤيد الكتاب من جامعة بوسطن وماساتشوستس مركز العلوم الحياة.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
