Оценка Нейродегенеративных фенотипов<em> Drosophila</em> Дофаминергических нейронов, забравшись на анализы и полного Иммуноокрашивание мозга
Summary
Здесь мы рассмотрим два анализы, которые были созданы для изучения возрастных нейродегенеративных дофаминергических (ДА) нейронов в<em> Drosophila</em>: Восхождение / испуга индуцированных отрицательном анализе геотаксис которая позволяет изучать функциональные эффекты да нейронов дегенерации и тирозин гидроксилазы иммуноокрашивания который используется для выявления и графа Д. А. нейронов в тотальных мозга.
Abstract
Дрозофилы является ценным организма моделью для изучения старения и патологических дегенеративных процессов в нервной системе. Преимущества летать в качестве экспериментальной системе, включают свой генетический трактабильность, короткий срок службы, а также возможность наблюдать и количественно анализируют сложные поведения. Выражение заболеваний связанных генов в специфических популяций нейронов головного мозга Drosophila, могут быть использованы для моделирования человеческих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера 5.
Дофаминергические (DA) нейроны являются одними из самых уязвимых популяций нейронов в процессе старения человеческого мозга. При болезни Паркинсона (БП), наиболее распространенными нейродегенеративных расстройств движения, ускоренной потери DA нейронов приводит к прогрессирующему и необратимому снижению двигательной функции. Помимо возраста и воздействия токсинов окружающей среды, потеря да нейронов усугубляется специфических мутаций в кодирующихили промоторных областей ряда генов. Выявление таких PD-связанных аллелей обеспечивает экспериментальную базу для использования Drosophila в качестве модели для изучения нейродегенерацию DA нейронов в живом организме. Например, экспрессия PD-связанный человеческий α-синуклеина гена у дрозофилы DA повторяет нейронов некоторые особенности болезней человека, например прогрессирующую потерю нейронов DA и снижение двигательной функции 2. Соответственно, эта модель была успешно использована для выявления потенциальных терапевтических мишеней при БП 8.
Здесь мы рассмотрим два анализов, которые обычно используются для изучения возрастных нейродегенеративных DA нейронов у дрозофилы: восхождение анализ, основанный на испуг индуцированных отрицательный ответ геотаксис и тирозин гидроксилазы иммуноокрашивания целого мозга взрослого монтирует контролировать количество да нейронов в разном возрасте. В обоих случаях в естественных условиях выражение UAS тransgenes в частности, в нейронах DA может быть достигнуто с помощью тирозин-гидроксилазы (TH) промотор-Gal4 драйверов линии 3, 10.
Introduction
Специфичность анализов, описанных здесь опирается на использование Gal4 шнура, который использует регуляторные последовательности гена тирозин-гидроксилазы для достижения конкретных выражение в дофаминергических нейронов 3. Тирозингидроксилаза катализирует первую и ограничивающей скорость стадией в синтезе дофамина. TH иммунореактивности в мозге взрослой мухи накладывается на допамин, что делает TH хорошим кандидатом для выявления да нейронов в естественных условиях (см., например, 6). Более того, характер экспрессии THGal4 является более конкретным, чем у других Gal4 линии, такие как DdcGal4, которая содержит регуляторные последовательности из гена допа-декарбоксилазы и приводит трансгенной экспрессии не только в нейронах DA, но и в серотонинергических нейронов и подмножества глиальные клетки три .
Feany и Бендер (2000) первым заметил, что пан-нейронов выражение PD-α человека связан-синуклеина ускоряет прогрессирующей потерей станцииrtle индуцированных негативное поведение геотаксис у дрозофилы. Мы наблюдали подобные результаты помощью DA-нейронов конкретных THGal4 линии ездить expressionof α-синуклеина трансгенов 10 и использовать этот функционал для чтения с целью изучения роли нейропротекторные Nrf2 пути в этом Drosophila модели БП 14. Конкретные анализа, описанного здесь адаптирован из 2 и 3.
Мозг дрозофилы содержит более 100 DA нейронов, расположены по меньшей мере 5 различных кластеров (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), которые могут быть визуализированы в тотальных мозга с помощью конфокальной микроскопии (см., например, 11 и 7). До сих пор спорным, является ли количество нейронов DA в мозге Drosophila снижается с возрастом 9, 11, однако возрастной нейродегенерации наблюдается у мух где PD-сцепленных генов мутировали / сверхэкспрессия для моделирования болезней человека5. Выражение человеческого α-синуклеина в DA нейронов имеет такой эффект, а значит, был использован в качестве модели для PD. Здесь мы опишем тест для DA нейронов рассчитывать на весь мозг монтирует использованием TH как клеточный маркер. Этот анализ был адаптирован от 13 до 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализы, описанные здесь обеспечить полезный подход к изучению роли определенных генов, сигнальных путей или небольших соединений в поддержании DA нейронов в процессе старения, а также в различных болезней, связанных генетическим фоном (см. обзор в 5).
Испуга-индуци…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Лев Pallanck для лета акции, Кристин Соммерс в технической помощи и Герасим Павлович Sykiotis за полезные обсуждения. Эта работа финансировалась подготовка NIH грант T32CA009363 к MCB
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.
References
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson’s Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson’s disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson’s disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
