جيل من تفرقوا Presomitic الأديم المتوسط الثقافات خلية التصوير من اسماك الزرد الإنقسام على مدار الساعة في خلايا واحدة
Summary
Somitogenesis هو عملية التنموية الإيقاعية التي مكانيا أنماط محور الجسم من أجنة الفقاريات. سابقا، قمنا بتطوير خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تستخدم للصحفيين الفلورسنت لمراقبة الجينات التي تدفع دوري هذه العملية. هنا، ونحن ثقافة فرقت الخلايا من هذه الخطوط والصورة التذبذبات على مر الزمن في المختبر.
Abstract
تجزئة هو عملية التخلق دورية ومتتابعة في الفقاريات. هذا التشكيل الإيقاعي من كتل من الأنسجة تسمى somites على طول محور الجسم هو دليل على وجود مذبذب الوراثية الزخرفة الجنين النامية. في الزرد، وتتكون على مدار الساعة داخل الخلايا تجزئة الدافعة للأعضاء عامل النسخ عائلتها / هس تنظيمها في الحلقات ردود فعل سلبية. لقد ولدت مؤخرا المعدلة وراثيا خطوط مراسل الفلورسنت لher1 الجين دوري أن ألخص نمط المكانية والزمانية من التذبذبات في الأديم المتوسط presomitic (PSM). باستخدام هذه الخطوط، قمنا بتطوير نظام الثقافة في المختبر الذي يسمح التحليل في الوقت الحقيقي من خلال تجزئة التذبذبات على مدار الساعة، والخلايا المعزولة PSM احد. عن طريق إزالة الأنسجة PSM من الأجنة وراثيا ومن ثم تفريق الخلايا من المناطق تتأرجح على الأطباق الزجاجية القاع، ونحن ولدت الثقافات مناسبة للالوقت الفاصل بين التصوير من إشارة مضان منالخلايا الفردية على مدار الساعة. ويوفر هذا النهج إطارا التجريبية والمفاهيمية للتلاعب المباشر على مدار الساعة لقرار تجزئة وحيدة الخلية غير مسبوقة، مما يسمح للخصائص خلية مستقلة وعلى مستوى الأنسجة لتمييزها وتشريح.
Introduction
تشكيل دورية للقطاعات على طول محور الجسم الفقاريات، أو somitogenesis، هو دليل على وجود مذبذب المكانية والزمانية في الجنين النامية. آلية يفضل السيطرة somitogenesis والمفاهيمية وصفها ب "على مدار الساعة واجهة الموجة" نموذج 1، حيث "ساعة" التي تتألف من مؤشرات التذبذب الخلوية، ويعتقد الآن أن تكون مدفوعة من قبل داخل الخلية التعبير الايقاعي من مجموعة من الجينات دوري 2، القراد قبالة تشكيل من somites من الأديم المتوسط presomitic (PSM). مع تطور الجنين، والنضج "واجهة الموجة" في PSM يتحرك بالتنسيق مع الأنسجة تراجع نحو الخلفي، وتباطؤ واعتقال مؤشرات التذبذب الخلوية لأنها تمر 3. معا، ويطلق على هذا النظام الديناميكي spatiotemporally على مدار الساعة تجزئة. النهج الحالي لدراسة تجزئة مدار الساعة فترة ثلاثة مستويات متزايدة من التنظيم من مذبذب الوراثية في الخلايا واحد إلى عشرة اقتران المحليةفي يحدث بين الخلايا، وأخيرا إلى التنظيم العالمي للمعلومات الموضعية في PSM الأنسجة الجماعية 4.
وتشير الدراسات السابقة إلى تجزئة مذبذب خلية مستقلة في الزرد يتكون من الجينات ومنتجات البروتين من النسخ لها / هس] factorfamily، التي يعتقد أنها تشكل رد الفعل السلبي من خلال القمع النسخي 5-7. إشارات الطريق دلتا / الشق بمزامنة التذبذبات بين الخلايا المجاورة وينظم الفترة الجماعي للسكان 8-10. جمعية جيل المستقبل تظهر إشارات الجزيئات التي تنتج في tailbud لبناء التدرج عبر PSM الزرد، وبالتالي افترض أن تساهم في تباطؤ واعتقال خلايا تتأرجح في 11 الأمامي. حتى الآن، وقد تم التحقيق في الأدوار الوظيفية لكل من هذه الجزيئات في somitogenesis التي كتبها طفرة جينية، حقن morpholino الحرارية صدمة الإفراط في التعبير، وخصم trea المخدراتtment من مكونات مدار الساعة والإشارات بين الخلايا 5،7،10،12. باستخدام هذه الاضطرابات، وقد يستدل تجزئة ظيفة على مدار الساعة من أوصاف مستوى الأنسجة من العيوب الجسيدة وفقدان التذبذبات موحدة في التعبير عن الجينات دوري مثل her1، her7، ودلتا C. ومع ذلك، وكلها تقريبا من هذه البيانات هي من أجنة الثابتة وتفشل في التقاط بدقة التغييرات التي هي متأصلة في وظيفة حيوية على مدار الساعة تجزئة. في الآونة الأخيرة، كشفت متعددة الأجنة الوقت الفاصل بين التصوير المسوخ الأولى مع الفترة مذبذب تتغير، ولكن قدمت هذه الملاحظات أيضا على مستوى 7،13 الأنسجة. وبالتالي، لم يحترم سلوك مذبذب خلايا مستقلة افترض خلال somitogenesis.
لقطات ثابتة من somitogenesis إعطاء صورة مكتملة لأنه، بطبيعته، هو الدافع وراء العملية من خلال نظام متذبذبة. أظهر العمل في وقت سابق من خلايا فأر وفرخ أن مستويات النصوارتفاع البروتين والخريف، ولكن أخذ العينات التذبذب ما يقرب من 2 ساعة كل 30 أو 45 دقيقة يقيد بالضرورة البيانات التي تم جمعها، وبالتالي فإن الاستنتاجات التي يمكن استخلاصها 14،15. دراسة مؤشرات التذبذب البيولوجية الأخرى، وأبرزها، والساعات الإيقاعية، تحركت بعيدا عن قياسات نظم الجينات والبروتينات التعبير لرصد الوقت الحقيقي باستخدام الفلورسنت وصحفيين للإضاءة الحيوية 16،17. هذه الأدوات ضرورية لإظهار الخصائص على مدار الساعة من الخلايا واحد 18. وقد تم تطوير مراسل إضاءة الحيوية للجين دوري Hes1 وتتميز الخلايا واحد في الماوس PSM 19 لفترة وجيزة. تم حساب متوسط فترة والتباين لعدد صغير من الخلايا، وتبين أن التذبذبات تستمر لعدة دورات في المختبر. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات لم تتناول كميا استقرار ومتانة تردد المذبذب والسعة، ما إذا كانت الخلايا يمكن أن تدخل بشكل عفوي أو التذبذبات الخروج،وكيف تحافظ على خلايا العلاقات مرحلتها. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم اختبارها آثار إشارات الجزيئات الموجودة في الجنين على مدار الساعة خلية مستقلة مباشرة. وبالتالي، هذه الخصائص الأساسية للمذبذب خلية واحدة لا تزال مجهولة تماما.
وقد وضعنا مؤخرا خطوط الأسماك المعدلة وراثيا باستخدام BAC recombineering 20 لدفع فينوس (YFP) للصحفيين مضان من her1 التعبير 30. هذه الخطوط استغلال العظة التنظيمية للموضع الكروموسومات سليمة التي تضمهم وألخص ديناميات الزماني والمكاني للنمط her1. هذا اختراق يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من التعبير الجيني في الجنين الزرد النامية في الجسم الحي. لدراسة الخصائص الأساسية للالتذبذبات خلية مستقلة وكيف يتم تنظيم مثل هذا التعبير مع مرور الوقت، ونحن في الآونة الأخيرة وضعت طريقة موثوق بها لعزل وسجل من الخلايا في المختبر PSM. هذا بروتوويصف العقيد كيف يمكننا استخدمت خطوط مراسل المعدلة وراثيا لدينا لتوليد مزارع الخلايا المشتتة، يمكننا من خلاله توصيف التذبذبات على مدار الساعة تجزئة الزرد في الخلايا واحد. يمكننا بالتالي معالجة المسائل العالقة في الحقل الذي لم تكن في متناول مع تحليل ثابتة أو على مستوى الأنسجة، فضلا عن التلاعب مباشرة على مدار الساعة تجزئة على مستوى خلية واحدة مع إشارات الجزيئات ومثبطات.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدراسة عملية الخلوية التي تجري على مدى التطور الجنيني، وعلماء الأحياء عادة استخدام هذا النهج في سياق الجنين بأكمله. ومع ذلك، ولكي نفهم تماما كيف يتصرف خلية واحدة ضمن إطار زمني التنموية، وهي طريقة لدراسة والتشويش على الخلايا الفردية في عزلة هو أيضا مفيد للغاية. عن طريق توليد فرقت الثقافات الخلية PSM باستخدام الأجنة الزرد المعدلة وراثيا لدينا الآن أداة لدراسة الخلية مباشرة الطابع المستقل من التذبذبات الوراثية في ساعة تجزئة بطريقة الكمي. فمن الممكن لقياس ديناميكية التذبذبات في مراسل الفلورسنت لدينا في مئات من الخلايا تحت مجموعة متنوعة من الظروف.
فترة احظ واحد من الخلايا في الثقافة أطول من الفترة somitogenesis في الجنين سليمة. نلاحظ أن ازدراع PSM سليمة في الثقافة يسلك أيضا التذبذبات أبطأ من الجنين سليمة (لا تظهر البيانات)، مما يوحي ثار فترة أطول لوحظ في خلايا معزولة لا يعود ببساطة إلى الأضرار الناجمة عن تشتت. ويلاحظ وجود فترة متغير والسعة في معظم لدينا وحيدة الخلية سلسلة زمنية. مصدر هذا التباين هو معروف، ولكن ينبغي أن تكشف تفاصيل مهمة عن دوائر صنع تيرة على مدار الساعة في تجزئة.
مع هذا الأسلوب يمكننا دراسة المكونات الجينية للتجزئة على المستوى الخلوي، والأسئلة العنوان الذي يتحدون لدراسة في الجنين كله. على سبيل المثال، من خلال إضافة للرقابة من جزيئات إشارة معروفة وجدت في الجنين النامية لثقافاتنا، يمكن أن ندرس آثارها على PSM مذبذب الخلوية واحد في مقايسة قوية وقابلة للتكرار. يفتح نظامنا الثقافة PSM الباب أمام إجراء تقييم دقيق للعوامل ما، وحده، أو بالاشتراك تعزيز التذبذبات في هذه الخلايا، ما هي العوامل التي تحول دون هذه التذبذبات، واختبار التفاعل بين هذه الجزيئات. مع هذه الأدوات في متناول اليد، ونحن نهدف إلىتقييم النماذج القائمة من somitogenesis التي تستند إلى بيانات على مستوى الأنسجة المنشورة، فضلا عن نتائج استخدام في الخلايا وحيدة لتوليد التنبؤات التي يمكن اختبارها في الجنين كله.
على حد علمنا، هذا هو أول الزرد بروتوكول الثقافة الخلية الأولية للالحاد تسجيل الوقت الفاصل بين مضان في الخلايا واحد؛ مزيد من التطوير والتنقيح من هذا البروتوكول هو بلا شك ممكن. بروتوكولات أخرى غالبا ما تستخدم الأجنة الزرد لتوليد خطوط الخلايا المستقرة التي يمكن transfected مع صحفيين وتستخدم للتصوير على المدى الطويل 27-29. بينما خطوط مستقرة هي مفيدة لتصوير عملية ليست مرتبطة توقيت التنمية، مثل الساعة اليومية، مسألة تجزئة الجنينية يتطلب التصوير على الفور في حين أن الخلايا لا تزال في متذبذبة، دولة السلف الخاصة بهم. مرة واحدة خلايا وقف تتأرجح، فإنها تفترض مصير الخلايا المتمايزة، وعندما تكون في الأنسجة، وستدرج في الجسيدة. فمن بوssible أنه مع عامل الحق أو عوامل موجودة في المختبر فإننا يمكن أن تولد الزرد خطوط خلية ثقافة PSM مثل التي من شأنها أن تبقى متذبذبة، مما يتيح بشكل ملحوظ الملاحظات على المدى الطويل، اضطرابات متتابعة متعددة، أو الفرز الفائق الإنتاجية.
ونحن نتوقع أن هذا الأسلوب في إعداد الثقافات الأولية من خلايا متناثرة للتصوير مرور الزمن هو مناسبة تماما لدراسة أي عملية الخلوية التي تحدث ضمن إطار زمني التنموية التي ليس دود باستخدام خطوط الخلايا الزرد مستقرة. عزلة متميزة الخلية الأنواع في مراحل نمو متميزة من خطوط مراسل المعدلة وراثيا المناسب، إما عن طريق تشريح أو عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد التفكك الجنينية، يمكن أن توفر الخلايا تبدأ. بعض التحسين من ظروف الثقافة، مسترشدة في ذلك المنشأ الجنينية من الخلايا، قد تكون مطلوبة. من خلال الجمع بين هذا البروتوكول مرنة وحساسة مع مجموعة متنامية بسرعة من الزرد المعدلة وراثياخطوط، ونحن نأمل أن تسهل في المختبر التنموية نهج البيولوجيا التي هي مكملة لأساليب الوراثية والجنينية الكلاسيكية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل EMBO طويل الأجل الزمالة (ABW)، وزمالة الدولية المؤسسة الوطنية للعلوم ما بعد الدكتوراه البحوث (ABW)، وماكس بلانك غزلشافت (ABW، DS، JS، أكو)، وهو يحفر-BB الزمالة (AO)، ومجلس البحوث الأوروبي في إطار الإطاري السابع المجتمعات الأوروبية برنامج STG-207634 (DS، أكو). نشكر رافي ديساي للتعليقات مفيدة على المخطوطة. نود أيضا أن نشكر MPI-CBG مرفق تعبير البروتين لإنتاج Fibronectin1 جزء الزرد، وموظفي مرفق الأسماك MPI-CBG للرعاية وصيانة خطوط الأسماك لدينا وMPI-CBG مرفق المجهر الضوئي للحصول على الدعم التصوير.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | |||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
References
- Cooke, J., Zeeman, E. C. A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis. J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139, 625-639 (2012).
- Dequeant, M. L., Pourquie, O. Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis. Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).
- Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. Quantitative approaches in developmental biology. Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).
- Oates, A. C., Ho, R. K. Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish. Development. 129, 2929-2946 (2002).
- Lewis, J. Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator. Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).
- Schroter, C., Oates, A. C. Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant. Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).
- Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock. Science. 317, 1911-1915 (2007).
- Ozbudak, E. M., Lewis, J. Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries. PLoS Genet. 4, e15 (2008).
- Herrgen, L., et al. Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock. Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).
- Sawada, A., et al. Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation. Development. 128, 4873-4880 (2001).
- Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism. PLoS Biol. 5, e150 (2007).
- Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development. Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Soroldoni, D., Oates, A. C. Live transgenic reporters of the vertebrate embryo’s Segmentation Clock. Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish. Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).
- Schroter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).
- Mould, A. P., et al. Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio). BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).
- Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach. Biochem J. 424, 179-189 (2009).
- Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish. Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).
- Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection. Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).
- Carr, A. J., Whitmore, D. Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods. Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).
- Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock. Nature. 404, 87-91 (2000).
- Soroldoni, D., et al. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (1126).
