Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen
Summary
Somitogenese ist eine rhythmische Entwicklungsprozess, die räumlich Muster die Körperachse von Wirbeltierembryonen. Bisher haben wir transgenen Zebrafischlinien, die fluoreszierenden Reporter nutzen, um die zyklischen Gene, die dieser Prozess vorangetrieben beobachten. Hier wir Kultur verteilt Zellen aus diesen Linien und Bild ihre Schwingungen über die Zeit in vitro.
Abstract
Segmentierung ist ein periodischer und sequentielle morphogenetischen Prozess bei Wirbeltieren. Diese rhythmische Bildung von Blöcken aus Gewebe genannt Somiten entlang der Körperachse ist Nachweis einer genetischen Oszillator Strukturieren des sich entwickelnden Embryos. Im Zebrafisch wird die intrazelluläre Uhr fahren Segmentierung der Mitglieder des Her / Hes Transkriptionsfaktor-Familie in den negativen Rückkopplungsschleifen organisiert zusammen. Wir haben kürzlich erzeugten transgenen fluoreszierenden Reporterlinien für die zyklische Gen HER1, die die räumlich-zeitliche Muster der Schwingungen in präsomitischen Mesoderm (PSM) zu rekapitulieren. Mit diesen Zeilen, ein in vitro-Kultursystem, die Echtzeit-Analyse der Segmentierung Uhr Schwingungen innerhalb einzelner, isolierter PSM Zellen erlaubt entwickelten wir. Durch das Entfernen von PSM Gewebe von transgenen Embryos und dann Dispergieren Zellen aus schwing Regionen auf Glasboden Gerichte erzielten wir Kulturen geeignet für Zeitraffer-Bildgebung der Fluoreszenzsignal voneinzelnen Taktzellen. Dieser Ansatz bietet eine experimentelle und konzeptuelle Rahmen für die direkte Manipulation der Segmentierung Uhr mit beispiellosen Einzelzellen-Auflösung, so dass seine zellautonome und Tissue Level-Eigenschaften zu unterscheiden und seziert werden.
Introduction
Die periodische Bildung von Segmenten entlang der Wirbeltierkörperachse oder Somitogenese, ist ein Beweis für eine räumliche und zeitliche Oszillator im sich entwickelnden Embryo. Die bevorzugte Mechanismus Steuerung Somitogenese ist konzeptionell von einem "Takt-und Wellenfront"-Modell ein, bei dem die "Uhr", bestehend aus zellulären Oszillatoren jetzt vermutlich intrazellulär durch die rhythmische Expression einer Reihe von Genen zyklischen 2 angetrieben werden, hakt die Bildung beschrieben Somiten von präsomitischen Mesoderm (PSM). Da der Embryo entwickelt, eine Reifung "Wellenfront" in der PSM bewegt sich zusammen mit der Geweberückschritte in Richtung der hinteren, Verlangsamung und verhaften zellulären Oszillatoren, wie es geht 3. Gemeinsam wird diese raumzeitlich dynamischen System die Segmentierung Uhr bezeichnet. Aktuelle Ansätze zur Segmentierung Uhr Spannweite drei zunehmenden Organisation der genetischen Oszillator in einzelnen Zellen auf lokale Kopplung th studierenan tritt zwischen Zellen und schließlich die weltweite Regulierung der Positionsinformationen in der kollektiven PSM Gewebe 4.
Frühere Studien legen nahe, die zellautonome Segmentierung Oszillator im Zebrafisch besteht aus Genen und Proteinprodukte aus der ihr / hes factorfamily Transkription, die gedacht werden, um eine negative Rückkopplungsschleife über Transkriptionsrepression 5-7 bilden. Die Delta / Notch-Signalwegs synchronisiert Schwingungen zwischen Nachbarzellen und reguliert die Tarifperiode der Bevölkerung 10.8. In der Schwanzknospe erzeugt Fgf Signalmoleküle scheinen einen Gradienten über die Zebrafisch-PSM zu bauen, und dabei die Hypothese aufgestellt, um zu verlangsamen und zu verhaften oszillierenden Zellen in der vorderen 11 beitragen. Bis jetzt haben die funktionellen Rollen jedes dieser Moleküle in Somitogenese durch genetische Mutation, Morpholino-Injektion, Hitzeschock-Überexpression und-Antagonist Medikament TREA suchttment Uhr von Komponenten und Signalisierung zwischen Zellen 5,7,10,12. Mit Hilfe dieser Störungen hat Segmentierung Uhr-Funktion von Gewebe-Level-Beschreibungen der Somitendefekten und den Verlust der gleichmäßigen Schwingungen in der Expression von Genen wie zyklische her1, her7 und Delta abgeleitet worden C. Doch fast alle diese Daten sind von Embryonen fixiert und nicht zu Veränderungen, was für das dynamische Funktion der Segmentierung Uhr sind genau zu erfassen. In jüngerer Zeit hat mehr Embryo Zeitraffer-Bildgebung die ersten Mutanten mit veränderter Oszillatorperiode offenbart, sondern diese Beobachtungen wurden auch bei der Gewebeniveau 7,13 gemacht. So wurde die Hypothese aufgestellt Verhalten der Zelle autonomen Oszillators während Somitogenese nicht beobachtet.
Statische Schnappschüsse von Somitogenese ein unvollständiges Bild, denn von Natur aus, wird der Prozess durch ein schwingfähiges System angetrieben. Frühere Arbeiten in Maus-und Küken-Zellen zeigten, dass das Niveau der Niederschriftund Protein-Aufstieg und Fall, aber Abtasten eines ca. 2 h Schwingung alle 30 oder 45 min beschränkt notwendigerweise die gesammelten Daten und damit die Schlussfolgerungen, die gezogen werden können 14,15. Studium der anderen biologischen Oszillatoren, vor allem, circadiane Uhren, hat sich von inszenierten Messungen von Gen-und Proteinexpression um Echtzeit-Überwachung mit Fluoreszenz-und Biolumineszenz Reporter 16,17 bewegt. Diese Instrumente sind wichtig für den Nachweis Uhr Eigenschaften von Einzelzellen 18. Ein Reporter der Biolumineszenz Hes1 zyklischen Gen wurde entwickelt und kurz in einzelnen Zellen der Maus PSM 19 aus. Die Durchschnittsperiode und der Varianz wurden für eine kleine Anzahl von Zellen berechnet wird, zeigt, dass Schwingungen bestehen für mehrere Zyklen in vitro. Allerdings haben diese Studien nicht quantitativ anzugehen, die Stabilität und Robustheit der Oszillator-Frequenz und Amplitude, ob Zellen können spontan betreten oder verlassen Schwingungen,und wie die Zellen behalten ihre Phasenbeziehungen. Zusätzlich können die Effekte von Signalmolekülen in der Embryos auf dem Zell-autonome Uhr wurden nicht direkt getestet. Folglich sind diese grundlegenden Eigenschaften der einzelnen Zelle Oszillator bleiben völlig unbekannt.
Wir haben vor kurzem transgene Fische Linien mit BAC Rekombination 20 bis Venus (YFP) Fluoreszenz-Reporter von 30 her1 Ausdruck fahren entwickelt. Solche Leitungen nutzen die regulatorischen Signale des intakten chromosomalen Locus in die sie eingebettet sind, und wiederholen die zeitliche Dynamik und räumlichen Muster der HER1. Dieser Durchbruch ermöglicht die Echtzeit-Überwachung der Gen-Expression in sich entwickelnden Zebrafischembryos in vivo. Um die grundlegenden Eigenschaften von Zell-autonome Schwingungen und wie solche Ausdruck wird über die Zeit geregelt zu studieren, haben wir vor kurzem eine zuverlässige Methode, um von PSM-Zellen in vitro zu isolieren und zu Rekord. Diese Protocol beschreibt, wie wir unsere Reporter transgenen Linien verwendet werden, um verteilte Zellkulturen, aus denen wir die Schwingungen des Zebrafisch-Segmentierung Uhr in einzelne Zellen zu charakterisieren generieren. Wir können damit noch offenen Fragen anzugehen in dem Feld, das nicht zugänglich mit statischen oder Gewebe-Level-Analyse waren, als auch direkt manipulieren die Segmentierung Uhr auf Einzelzellebene mit Signalmolekülen und Inhibitoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um einen zellulären Prozess, der im Laufe der embryonalen Entwicklung stattfindet, zu studieren, Biologen verwenden typischerweise einen Ansatz im Kontext des gesamten Embryos. Jedoch zu verstehen, wie eine einzelne Zelle in einem Entwicklungszeitrahmen verhält, ist eine Methode, zu prüfen und zu stören einzelnen Zellen isoliert auch sehr nützlich. Durch die Erzeugung verteilt PSM Zellkulturen unter Verwendung von transgenen Zebrafischembryonen haben wir jetzt ein Werkzeug, um die Zelle autonome Natur des genetischen Schwingungen im Segmentierung Uhr in einer quantitativ direkt studieren. Es ist möglich, die Dynamik der Schwingungen im Fluoreszenzreporter in Hunderten von Zellen, die unter einer Vielzahl von Bedingungen zu messen.
Der Beobachtungszeitraum von Einzelzellen in Kultur ist länger als die Periode Somitogenese im intakten Embryo. Wir beobachten, dass eine intakte PSM Explantat in Kultur zeigt auch langsamer Schwingungen als das intakte Embryo (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet that die in isolierten Zellen beobachtet längeren Zeitraum ist nicht einfach bei einem Schaden aus Zerstreuung. Eine variable Periode und Amplitude wird in den meisten unserer Single-Cell-Zeitreihen beobachtet. Die Quelle dieser Variabilität ist nicht bekannt, sollte aber wichtige Details über Tempo-Schaltungen machen die Segmentierung der Uhr zeigen.
Mit dieser Methode können wir die genetischen Komponenten der Segmentierung auf der zellulären Ebene, und Fragen, die herausfordernd sind, um in der ganzen Embryo untersuchen zu studieren. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von bekannten Signalmoleküle in den sich entwickelnden Embryo in unseren Kulturen zu finden, können wir ihre Auswirkungen auf die einzelnen PSM zellulären Oszillators in einer robusten und reproduzierbaren Assay zu prüfen. Unsere PSM Kultursystem öffnet die Tür zu einer strengen Bewertung, welche Faktoren allein oder in Kombination zu fördern Schwingungen in diesen Zellen, welche Faktoren diese Schwingungen zu verhindern, und um das Zusammenspiel zwischen solchen Molekülen zu testen. Mit diesen Werkzeugen in der Hand, wollen wirbewerten bestehenden Modelle der Somitogenese veröffentlicht, die auf Gewebe-Level-Daten, sowie die Nutzung Ergebnisse in einzelnen Zellen basieren, um Vorhersagen, die in der ganzen Embryo getestet werden können, zu erzeugen.
Nach unserem Wissen ist dies der erste Zebrafisch primären Zellkultur-Protokoll für akute Zeitraffer-Aufnahme der Fluoreszenz in Einzelzellen; Weiterentwicklung und Verfeinerung dieses Protokolls ist kein Zweifel möglich ist. Andere Protokolle verwenden oft Zebrafischembryonen in stabilen Zelllinien, die mit Reporter transfiziert und für die Langzeitabbildungs 27-29 verwendet werden kann, zu erzeugen. Während stabile Linien sind nützlich für die Abbildung ein Prozess, der nicht für die Entwicklung Timing, wie der circadianen Uhr gebunden ist, ist die Frage der embryonalen Segmentierung erfordert sofortige Bildgebung während Zellen noch in den oszillierenden, Stammvater Staat. Sobald Zellen stoppen Schwing, nehmen sie eine differenzierte Zelle Schicksal, und als im Gewebe, würde sich in ein Somiten integriert werden. Es ist possible dass mit dem richtigen Faktor oder in vitro vorhanden Faktoren, die wir PSM-wie Zebrafisch-Zellkulturlinien, die Schwingungs bleiben würde, so dass deutlich mehr Zeitbeobachtungen, mehrere aufeinander folgende Störungen oder Hochdurchsatz-Screening erzeugen könnte.
Wir erwarten, dass diese Verfahren zur Herstellung von Primärkulturen von dispergierten Zellen für Zeitabbildungs ist gut geeignet für die Untersuchung von jedem zellulären Prozess, der in einer Entwicklungszeitrahmen, die nicht zugänglich Zebrafisch unter Verwendung stabiler Zelllinien auftritt. Die Isolierung der verschiedenen Zelltypen auf unterschiedliche Entwicklungsstadien aus den entsprechenden transgenen Linien Reporter, entweder über Dissektion oder über FACS nach embryonalen Dissoziation, könnte die Ausgangszellen zu liefern. Einige Optimierung der Kulturbedingungen, die embryonalen Ursprungs der Zellen geführt wird, kann erforderlich sein. Durch die Kombination dieser flexiblen und sensiblen Protokoll mit der schnell wachsenden Sammlung von transgenen ZebrafischLinien, hoffen wir, ein in vitro-Ansatz der Entwicklungsbiologie, die komplementär zu klassischen genetischen und embryologischen Methoden ist, zu erleichtern.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein EMBO-Langzeit-Stipendiums (ABW) unterstützt, ein National Science Foundation International Postdoctoral Research Fellowship (ABW), die Max-Planck-Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), ein DIGS-BB-Stipendium (AO), und der Europäische Forschungsrat im Rahmen der Europäischen Gemeinschaften Siebten Rahmenprogramms STG-207634 (DS, ACO). Wir danken Ravi Desai für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Wir möchten auch die MPI-CBG-Protein-Expression Anlage für die Herstellung des Zebrafisch Fibronectin1 Fragment, dem Fisch den zuständigen Personen MPI-CBG für die Pflege und Wartung unserer Fisch-Linien und des MPI-CBG Lichtmikroskopie-Anlage für die Bildgebung Unterstützung danken.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | |||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
References
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