L'activation des neurones somatosensoriels optogenetic poisson zèbre en utilisant Chef-tdTomato

Le développement de méthodes optogenetic pour favoriser ou inhiber l'excitabilité neuronale des longueurs d'onde de la lumière défini a permis d'étudier la fonction des populations distinctes de neurones dans les circuits neuronaux contrôlant le comportement ^{1, 19, 21.} Cette technique est souvent utilisée pour activer des groupes de neurones, mais il peut aussi être utilisé pour activer des neurones individuels. Embryons de poisson zèbre sont particulièrement favorables à ces méthodes car elles sont translucides, leur système nerveux se développe rapidement, et la création d'animaux transgéniques est rapide et la routine. Toutefois, d'importants obstacles techniques doivent être surmontés pour atteindre de manière fiable activation seul neurone.

Pour optimiser une procédure pour l'activation des neurones optogenetic poisson zèbre simples, nous nous sommes concentrés sur les neurones somatosensoriels. Embryons de poisson zèbre détecter une variété de stimuli somatosensoriels l'aide de deux populations de neurones: les neurones du trijumeau, qui innervent la tête, et Rohon-Barbe (RB), les neurones qui innervent le reste du corps. Chaque neurone du trijumeau et RB projette un axone périphérique qui se ramifie abondamment dans la peau pour détecter des stimuli et un axone central qui se connecte à circuits neuronaux en aval. Animaux réagissent au toucher dès 21 heures après la fécondation (HPF), indiquant que les circuits cohérents somatosensoriels ont formé ^{5, 18.} Au cours du développement larvaire au moins une synapse du trijumeau et RB neurones sur la cellule de Mauthner pour activer réactions de fuite classiques, mais l'accumulation de preuves suggère qu'il existe plusieurs classes de neurones somatosensoriels avec différents modèles de connectivité qui peuvent susciter des variations sur le comportement ^{Escape 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17.} Notre motivation pour développer cette méthode était de caractériser la fonction du comportement des différentes classes de neurones somatosensoriels, mais cette approche pourrait en principe être utilisée pour étudier la fonction des neurones presque toute ou d'une population de neurones dans larval poisson zèbre.

Douglass et al. Précédemment décrit un procédé d'activation channelrhodopsin-2-exprimer neurones somatosensoriels avec la lumière bleue, provoquant ^{3 Comportement} fuite. Leur approche utilisée un élément activateur du gène Isl1 pour diriger l'expression de ChR2-EYFP dans les neurones somatosensoriels. Ce transgène, cependant, a été signalé pour afficher une fluorescence relativement faible, ce qui nécessite la co-injection d'un deuxième rapporteur, SAMU :: GFP, pour permettre la visualisation des cellules exprimant ChR2-EYFP. Cette approche a été utilisée pour obtenir des réponses de comportement entre 24-48 hpf, mais n'a jamais pu obtenir une réponse cours des dernières 72 hpf. Ainsi, bien que cette méthode fonctionne pour l'étude de circuits neuronaux à très premiers stades larvaires (24-48 hpf), elle est insuffisante pour caractériser les circuits neuronaux et des réponses comportementales dans les larves plus âgées, quand plus diverses réactions comportementales sont apparentes et les circuits neuronaux sont plus matures.

Nous avons cherché àaméliorer la sensibilité de cette technique dans le but de caractériser la fonction de sous-populations de neurones RB larvaires. Pour améliorer l'expression on utilise un activateur spécifique somesthésiques (CREST3) ²⁰ pour diriger l'expression de LexA-VP16 et un tronçon de séquences d'opérateurs LexA (4xLexAop) ¹¹ pour amplifier l'expression d'un marquées par fluorescence canal activé par la lumière. Cette configuration amplifié expression du canal, ce qui élimine la nécessité d'une co-expression d'un journaliste de seconde et qui nous permet de déterminer directement l'abondance relative de la voie dans chaque neurone. En utilisant la séquence LexA / LexAop a l'avantage supplémentaire de permettre d'introduire le transgène dans des lignes de reporter poisson zèbre qui utilisent le système Gal4/UAS. L'expression transitoire de ce transgène donné lieu à différents niveaux d'expression, mais était généralement assez robuste pour visualiser à la fois le corps cellulaire et les projections axonales des neurones individuels sur plusieurs jours. Pour optimiser la sensibilitélité à la lumière, nous avons utilisé la lumière activée canal chef, une variante channelrhodopsin constitué d'une chimère de channelopsin-1 (Chop1) et channelopsin-2 (Chop2) avec un site de liaison à une hélice boucle EF ^13. Ce canal est activé à la même longueur d'onde que ChR2, mais nécessite plus faible intensité lumineuse pour l'activation, la rendant plus sensible que les autres canaux couramment utilisés, y compris ChR2. La protéine chef était fusionnée à la protéine fluorescente rouge, tdTomato, ce qui nous permet de cribler l'expression de protéines sans activer le canal. Comme une source de lumière, nous avons utilisé un pompé par diode à semi-conducteurs (DPSS) laser couplé à un câble à fibre optique pour offrir une précision, une grande puissance d'impulsion de lumière bleue à une région spécifique des larves. Cela nous a permis de focaliser la lumière laser sur les neurones individuels, éliminant ainsi la nécessité de trouver de rares animaux transgéniques exprimant le canal en un seul neurone. En utilisant cette approche, nous avons réussi à activer les neurones RB simples, enregistrer la réponse comportementales avec une caméra vidéo à grande vitesse, et les neurones d'image à haute résolution activés par microscopie confocale.