Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies
Summary
Biophysikalische und biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen den membranständigen eingebettet Proteindomänen stehen viele technische Herausforderungen, von denen der erste Abschluß einer entsprechenden Studie Material ist. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Reinigung Disulfid-stabilisierten Transmembran-Peptid-Komplexe, die geeignet für die Strukturanalyse durch Lösungspolymerisation Kernspinresonanz (NMR) und andere analytische Anwendungen sind.
Abstract
Physikalische Wechselwirkungen zwischen den Lipid-eingebetteter Alpha-Helix-Domänen von Membranproteinen spielen eine entscheidende Rolle bei der Faltung und Montage von Membranprotein-Komplexen und bei dynamischen Prozessen wie Transmembran (TM)-Signalisierung und Regelung Zelloberflächenprotein Ebenen. Das Verständnis der strukturellen Merkmale der Fahrt die Assoziation von bestimmten Sequenzen erfordert ausgefeilte biophysikalische und biochemische Analysen der TM-Peptid-Komplexe. Allerdings macht die extremen Hydrophobie Transmembrandomänen sie sehr schwierig zu handhaben Verwendung von Standard-Techniken der Peptidchemie, und Herstellung von geeigneten Lehrmaterial erweist sich oft als prohibitiv anspruchsvoll. Identifizieren Bedingungen, unter denen Peptide stabile helicale Konformationen und bilden Komplexe annehmen kann spontan fügt eine weitere Schwierigkeit. Hier stellen wir ein Verfahren zur Herstellung von Homo-oder Hetero-dimeren TM-Peptid-Komplexe aus Materialien, die in E. exprimiert werden coli, wodurch Einbau von stabilen Isotopenmarker für Kernspinresonanz (NMR) oder nicht-natürlichen Aminosäuren für andere Anwendungen relativ kostengünstig. Die wichtige Neuerung an diesem Verfahren ist, dass TM-Komplexe gebildet werden und gereinigt, wie kovalent assoziiert (Disulfid-vernetzt) Anordnungen, die stabile, homogene stöchiometrische und Strukturen bilden können, wenn sie in Wasch-, Lipid oder eine andere Membran-mimetischen Materialien rekonstituiert. Wir präsentieren auch sorgfältig optimierten Verfahren zur Expression und Reinigung, die in gleicher Weise anwendbar, ob die Herstellung von ein TM-Domänen oder vernetzte Komplexe sind und beraten für die Anpassung dieser Methoden, um neue TM-Sequenzen.
Introduction
Dieses Protokoll Angaben eine Prozedur entwickelten wir zu Disulfid-stabilisierten Komplexe von Transmembran (TM)-Peptide für strukturelle Untersuchungen mittels NMR-Lösung zu erzeugen haben. Das Verfahren nutzt die Expression durch die robuste ΔtrpLE1413 Fusionssystem (siehe unten) ergab und ermöglicht TM-Peptid-Komplexe mit definierter Zusammensetzung zu erzeugenden mit hochentwickelten stabilen Isotopen Markierungstechniken für moderne mehrdimensionalen NMR-Experimente werden. Wir haben diese Techniken eingesetzt werden, um mehrere NMR-Strukturen, die wichtige neue Informationen darüber, wie Lymphozyten-Aktivierung Immunrezeptoren werden aus mehreren Membran-Protein-Untereinheiten durch Interaktionen zwischen ihren TM-Domänen zusammengesetzt (kürzlich in 1 bewertet) ergab bestimmen. Diese Techniken sind auf viele andere Membranprotein Systeme sowie einer Vielzahl von nachgeschalteten analytischen Methoden zusätzlich zur Lösung NMR. Während die hier angegebene Beispiel nutzt nativen Cysteinresteum einen Komplex, der die natürliche Disulfid-gebundenen Proteins nachahmt, das Design ist gleichermaßen gut für die Erstellung von engineered Disulfidbindungen, um Komplexe, die normalerweise miteinander durch schwächere, nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie Homo-und Hetero-dimeren TM Komplexe stabilisieren geeignet gehaltene epidermal growth factor receptor (EGFR)-Familie Proteinen 2-4 oder heterodimeren αβ Integrin-Komplexen 5,6.
Extrem hydrophoben Peptidsequenzen wie die von der Lipid-Doppelschicht abgeleitet umspannenden Teile TM Proteine sind äußerst schwierige Themen für biochemische und biophysikalische Studien. Zusätzlich dazu, dass sehr schwierig zu manipulieren Verwendung von Standard-Protein-und Peptidchemie Techniken, sind sie oft ziemlich toxisch für Zellen und sind daher schwer rekombinant herzustellen. Wir 7,8 und andere 9-11 gehabt haben bedeutende Erfolge Ausdruck solch schwierigen Peptidsequenzen in Bakterien als in-frame carboxyterminalenFusionen mit einer modifizierten Version des ΔtrpLE1413 Sequenz aus dem E. abgeleitete coli trp Operon 12. Die ~ 13 kDa Polypeptid trpLE von dieser Sequenz codierten können in hohen Konzentrationen unter einem T7-Promotor erzeugt werden und vollständig in Einschlusskörpern, wo Probleme bezüglich Toxizität und / oder Instabilität umgangen lokalisiert. Modifikation der Sequenz durch Hinzufügen einer Amino-terminalen Histidin-Tag 9-13 und Eliminierung von internen Methionin und Cystein-Reste aus der Sequenz 14 trpLE erlaubt trpLE-Peptid-Fusionen durch Metallionen-Affinitätschromatographie gereinigt werden und verdaut mit Cyanogenbromid (CNBr ), um den gewünschten Peptidsequenz. Wir haben erfolgreich dieses System verwendet, um mehr als ein Dutzend verschiedene Sequenzen als trpLE Fusionen darstellen Membranprotein-Fragmente, die weniger als vier Transmembrandomänen enthalten und exprimieren (7,8 und unveröffentlichte Ergebnisse; siehe auch Abschnitt Diskussion).
Diewichtige Neuerung in diesem Protokoll ist die Identifizierung von Bedingungen, unter denen die unstrukturierte und sehr schlecht löslich trpLE-TM Fusionen effizient im Rahmen eines optimierten Workflow Disulfid-vernetzt werden können. Mehrere Aspekte der Expression mit hoher Ausbeute, die Handhabung und Reinigung von Peptid Produkte wurden ebenfalls gründlich optimiert, und den Empfehlungen hier vorgestellten gleichermaßen relevant für die Produktion von Nicht-Disulfid-vernetztes (monomeren) TM Peptid Produkte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Expression von trpLE-TM Fusionen. Nach unserer Erfahrung sind trpLE-TM Fusionen schlecht in eine reiche Kultur-Medium bei 37 ° C angegeben, und die Kultur hier beschriebenen Bedingungen bewährt für viele verschiedene Sequenzen mit 1-4 Transmembrandomänen mit Ausbeuten bis hin bewährt haben 50 bis 150 mg / l reines, intaktem Fusionsprotein. Fusions-Codierung Drei-oder Vier-TM GPCR Fragmente (TM1-humanen CCR5 TM3 und TM4-TM7 bezeichnet) oder ein Kern katalytisches Fragment von menschlichem Signalpeptidpe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Und der Regierung von Victoria (VESKI Innovation Fellowship MEC; Finanzierung dieser Arbeit wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme [IRIISS] Zuschuss an WEHI NHMRC Projektförderung 1011352 zur MEC und MJC) vorgesehen ist; Victorian State Government Operational Support der Infrastruktur, um WEHI). MEC ist ein Queen Elizabeth II Fellow des Australian Research Council. EFXB dankt für die Unterstützung aus der Norma Hilda Schuster Scholarship Program an der University of Melbourne.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
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