Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies
Summary
Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.
Abstract
Fysieke interactie tussen het lipide-ingebedde alpha-helix domeinen van membraaneiwitten spelen een cruciale rol in vouwing en assemblage van membraaneiwit complexen en dynamische processen zoals transmembraan (TM) signalisatie en regulatie van celoppervlak eiwitniveaus. Begrijpen van de structurele kenmerken de associatie van een bepaalde sequenties vereist geavanceerde biofysische en biochemische analyses van TM peptide complexen. De extreme hydrofobiciteit van TM domeinen maakt ze zeer moeilijk te manipuleren met behulp van standaard peptide chemische technieken en productie van geschikte studiemateriaal blijkt vaak onbetaalbaar uitdaging. Het identificeren van de voorwaarden waaronder peptiden kan aannemen stabiele spiraalvormige conformaties en vorm complexen spontaan voegt een extra moeilijkheidsgraad. Hier wordt een procedure voor de productie van homo-of hetero-dimere TM peptide complexen uit materialen die worden uitgedrukt in E. coli, zodat opname van stabiele isotooplabels voor nucleaire magnetische resonantie (NMR) of niet-natuurlijke aminozuren voor andere toepassingen relatief goedkoop. De belangrijkste innovatie in deze methode is dat TM complexen worden geproduceerd en gezuiverd zoals covalent verbonden (disulfide-verknoopte) samenstellingen die vormen stabiele, homogene en stoichiometrische structuren na reconstitutie in detergent, lipide of andere membraan-mimetische materiaal. We presenteren ook zorgvuldig geoptimaliseerde procedures voor expressie en zuivering die evenzeer van toepassing of het produceren van een TM-domeinen of verknoopt complexen en geven advies voor de aanpassing van deze methoden om nieuwe TM sequenties.
Introduction
Dit protocol gegevens een procedure we hebben ontwikkeld om disulfide-gestabiliseerde complexen van transmembraan (TM) peptiden voor structurele studies met oplossing NMR produceren. De procedure maakt gebruik van de robuuste expressie geboden door de ΔtrpLE1413 fusiesysteem (zie hieronder) en kunnen TM peptide complexen gedefinieerde samenstelling worden gegenereerd met behulp van geavanceerde stabiele isotopen labeltechnieken voor moderne multi-dimensionale NMR experimenten. Wij hebben gebruik gemaakt van deze technieken naar verschillende NMR structuren die belangrijke nieuwe informatie over hoe lymfocyt-activerende immunoreceptors zijn opgebouwd uit meerdere membraan eiwitsubeenheden door interacties tussen de TM-domeinen (recent beoordeeld in 1) geopenbaard te bepalen. Deze technieken zijn van toepassing op vele andere membraaneiwit systemen alsmede diverse downstream analysemethoden naast oplossing NMR. Terwijl de hier gegeven voorbeeld maakt gebruik van inheemse cysteïnerestenom een complex dat de natuurlijk disulfide-gebonden eiwit nabootst, het ontwerp is ook geschikt voor het maken van kunstmatige disulfide bindingen met complexen die normaal worden bijeengehouden door zwakkere niet-covalente interacties, zoals homo-en hetero-dimere TM complexen stabiliseren epidermale groeifactor receptor (EGFR)-familie eiwitten 2-4 of heterodimere αβ integrine complexen 5,6.
Zeer hydrofoob peptide sequenties zoals die afgeleid van de lipide dubbellaag omspannende delen van TM eiwitten zijn bijzonder moeilijk onderwerpen voor biochemische en biofysische studies. Behalve zeer moeilijk te manipuleren met behulp van standaard eiwitten en peptiden chemische technieken, ze zijn vaak toxisch voor cellen en zijn daarom moeilijk recombinant produceren. We 7,8 en anderen negen-elf hebben gehad groot succes uitdrukken zulke moeilijke peptidesequenties in bacteriën als in-frame carboxyterminalefusies met een aangepaste versie van de ΔtrpLE1413 sequentie afgeleid uit de E. coli trp operon 12. De ~ 13 kDa trpLE polypeptide gecodeerd door deze sequentie worden geproduceerd met hoge niveaus onder een T7 promoter en geheel gelokaliseerd insluitingslichamen waar problemen inzake toxiciteit en / of instabiliteit worden omzeild. Wijziging van de sequentie door toevoeging van een amino-terminale histidine tag 9-13 en eliminatie van interne methionine en cysteine residuen van de sequentie 14 trpLE toegestaan trpLE-peptide fusies gezuiverd worden door metaal-ion affiniteitschromatografie en geknipt met cyanogeenbromide (CNBr ) om de gewenste peptidesequentie vrij. We hebben met succes gebruikt dit systeem om de meer dan een dozijn verschillende sequenties als trpLE fusies die membraaneiwit fragmenten die maar liefst vier TM-domeinen bevatten uiten (7,8 en niet gepubliceerde resultaten, zie ook DISCUSSIE sectie).
Debelangrijke innovatie in dit protocol is de identificatie van de voorwaarden waaronder de ongestructureerde en zeer slecht oplosbaar trpLE-TM fusies kan efficiënt disulfide-verknoopt in het kader van een gestroomlijnde workflow. Verschillende aspecten van high-yield expressie, behandeling en zuivering van peptide producten zijn ook goed geoptimaliseerd en de aanbevelingen hier gepresenteerde even relevant voor de productie van niet-disulfide-verknoopte (monomeer) TM peptide producten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Expressie van TM trpLE-fusies. Onze ervaring is trpLE-TM fusies slecht uitgedrukt in rijke kweekmedium bij 37 ° C en de kweekomstandigheden hier beschreven zijn effectief gebleken voor verschillende sequenties die een tot vier domeinen met TM opbrengsten variërend 50 tot 150 mg / L zuiver, intact fusie. Fusies coderen drie of vier TM GPCR fragmenten (humane CCR5-TM1 TM3 en TM4-TM7 respectievelijk) of een kern katalytisch fragment van humaan signaalpeptide peptidase (vier domeinen TM, zie ref 15) he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering voor dit werk wordt geleverd door de National Health en Medical Research Council van Australië (NHMRC projectsubsidie 1011352 naar MEC en MJC; onafhankelijke onderzoeksinstituten Infrastructure Support Scheme [IRIISS] subsidie aan WEHI) en de Victoriaanse regering (Veski Innovation Fellowship aan MEC; Victoriaanse Deelstaatoverheid operationele infrastructuur te ondersteunen om WEHI). MEC is een Koningin Elizabeth II Fellow van de Australian Research Council. EFXB erkent steun van de Norma Hilda Schuster Scholarship Program aan de Universiteit van Melbourne.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer–monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. 생화학. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer’s amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
