成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

全ての実験は、動物のケアと処理のための規制のオタワ大学によると取り扱われていました。 プロトコルの概要については表1を参照してください。 1。アイソレーションを開始する前に次の解決策を準備します。 0.2％コラゲナーゼタイプDMEM中で私（ダルベッコ改変イーグル培地、110 mg / mlのピ​​ルビン酸ナトリウムによる高グルコース、L-グルタミン）。については、2つのEDL筋肉はDMEM中で0.2％Collagenease 2mlの準備をします。 0.22μmフィルターを通して溶液をフィルタリングします。 37℃prewarm分離の10分前、℃の水浴インチ原液コラゲナーゼの追加のアリコートを、後で使用するために-20℃で凍結することができます。 注：この手順のすべてを通してピルビン酸ナトリウムを含むDMEMを使用しています。繊維は、ピルビン酸ナトリウムを含まない培地では存続しません。 洗濯メディア（すべての洗浄を行うために使用します）。 1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを補足するものです。 0を介してフィルタリング使用前にフィルター0.22μmである。 筋線維培地。 20％FBS、1％ニワトリ胚エキス及び1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを補足するものです。使用前に0.22μmのフィルターでろ過。 コー​​ティングされた料理をマトリゲル。時間の長い期間のための培養繊維に、我々は、コーティング基材としてマトリゲルの使用をお勧めします。マトリゲルコートディッシュを準備するには、4℃で一晩マトリゲルのアリコートを解凍します。一日を過ごした後、DMEM中マトリゲル1:10に希釈します。すべての回で4℃でCをマトリゲルを維持し、これは塗布ムラが生じるマトリゲルソリューション内で微細な結晶を作成するので、急激な温度変化を避けてください。氷の上にコーティングされる皿を置きます。表面を覆うだけで十分なボリュームでコートディッシュ。それは1分間座ってみましょう。完全に残ったマトリゲルを削除します。使用前に、または一晩少なくとも3時間37℃で食器乾燥させます。 注：4＆ドで保存した場合、希薄化後のマトリゲルのアリコートは、コーティングの目的のために複数回再使用することができますグラム、C. 最後に、70％エタノールを用いて顕微鏡ステーションと解剖ツールを清掃してください。 2 EDLのアイソレーションは、（1マウス）は、次のように5プラスチック製ペトリ皿を（60 * 15ミリメートル）の準備のために： 分離のための四つの皿（筋解離のための1、シリアル洗浄のための3）。すべての料理は、プラスチックに付着する筋繊維を防ぐために馬血清（HS）でコーティングされている必要があります。コー​​ト、それぞれの皿にウマ血清のピペット3ミリリットル、均一なコーティングを可能にするスワールに、馬の血清を除去し、少なくとも30分間皿は乾燥させてください。各皿にDMEMの4ミリリットルを追加します。使用に先立って、5％CO 2インキュベーター内で37℃で料理をしてください。 注意：滅菌守れば馬の血清を、複数回再使用することができます。あるいは、DMEM中10％HSの溶液がコートディッシュに使用することができます。全体のプロトコルを通して、HSコートディッシュを使用して、浮動小数点の条件で培養するとき筋線維。 一皿は、分離後の培養線維に使用されます。 Altキーernative皿のサイズやフォーマットは、下流のアプリケーションに応じて、筋繊維の最終培養に使用することができます。しかし、我々は、60 * 15ミリメートルより大きい皿の大きさを示唆していない。ハイパー収縮が発生する前に、筋線維は、もはやより96時間懸濁状態に維持することができます。長い培養時間のために、私たちはマトリゲル被覆皿やプレートの使用をお勧めします。 筋肉処理および筋線維操作のための1小口径ピペット用の大口径ピペット：1繊維の分離（2 EDL）は、2つの滅菌パスツールピペットを準備します。ピペットのエッジを滑らかにするために、所望の長さと熱ポリッシュに各ガラスピペットを切断するためにダイヤモンドペンを使用しています。炎を使用することにより、小口径ピペットの先端カーブ。これは、単繊維を処理するのに役立ちます。火炎滅菌する。使用前にHSとコートが各ピペット。 2。筋肉の解剖と消化 Rosa26TdTomato（;これらの実験の目的は、8週齢のSV129、Pax7クレエCklr用Pax7Cre-TdTomato）およびMyf5-CRE; Rosa26YFPを使用した。 70％エタノールで後肢を吹き付けます。手順の実行中に後肢のより良い理解を持っているために、支持基板に動物（顔アップ）ピン。 はさみの助けを借りて、四肢の全体の長さを切って、基礎となる筋肉を公開します。皮膚だけでなく、任意の髪の毛や毛皮（ 図1A）を取り外します。 細かいはさみと、下層にある筋肉を損傷することなく、薄い筋膜を介してカット。視覚的にEDLをローカライズします。 EDLはちょうど前脛骨筋（TA）の筋肉の下に後肢の前方コンパートメントに含まれています。 2鉗子の助けを借りて、遠位腱を公開します。 鋭いCohann-Vannas春ハサミで遠位腱（TAとEDL両方の）カット。 鉗子の助けを借りて、彼らの腱によって、TAとEDL筋肉の両方を保持し、微妙に近位端に向かって筋肉を引き上げます。この時点では、はっきりと見ることができるはずですただTAの筋肉の下にEDL筋肉。さて、反対方向（ 図1B）の2つの腱を引っ張ることにより、TA筋からEDLを区切ります。これが筋繊維を傷めますので、この操作を実行中にEDL筋肉をストレッチングは避けてください。 EDLの腱を公開します。より良い近位腱を視覚化するためには、TA筋肉を削除するには、この点で助けるかもしれない。また、膝の周りにいくつかの結合組織（ 図1C）を遮断するのに役立つことがあります。 近位腱を切って、優しく、EDL（ 図1D）を取り外します。 その腱、筋肉を保持することによって、先に調製したコラゲナーゼ溶液2mlに転送します。水浴中で37℃でインキュベートする。 注：正常な繊維の分離のために、それは筋線維の整合性が維持されるように腱から腱にEDLを分離することが重要です。 2.3から2.9までの手順が解剖顕微鏡下で行うことができる。あるいは、MAGNの使用ガラスをifyingことも筋肉の方のビューを持っているのを助けるかもしれません。 第二EDLを分離するために2.3から2.9の手順を繰り返します。同じチューブ内の第二のEDLを転送します。でこぼこの消化を避けるために、第二のEDLの単離は、わずか5分後の最初に完了する必要があります。 注1：インキュベーション時間は、コラゲナーゼ活性に応じて調整する必要があるかもしれません。長くしたり短くインキュベーションは、サイズ、年齢および/ ​​または筋肉の状態（ 例えば、線維筋肉は長い消化時間を必要とする）に応じて必要となる場合があります。 注2：筋肉消化時に休止状態、攪拌下、衛星細胞の挙動を調べる場合は衛星細胞10を活性化することができる。 消化時間の間、定期的に過剰消化を回避するために、筋肉を確認してください。筋肉がほぐれ始め、筋繊維が表示されているときに消化を停止します。消化を停止するには、慎重にしたDMEM（dissociati 4mlで温めておいたシャーレに、両方の筋肉を転送皿の上）。この操作を実行するには、大口径のピペットを使用しています。 注：Hyper委託筋繊維の分離では、この必然的結果として筋肉の過剰消化を避ける。 3。単一筋線維解離と文化筋繊維を解除するには、繊維が自然に放出され始めるまで、暖かい培地で筋肉をフラッシュするために大口径ガラスピペットを使用しています。これは必然的に有害な繊維が発生するので、筋をひいて粉にするしないでください。解剖顕微鏡下でこれと次の手順を実行します。 希望数に達するまで、筋繊維を放出続ける。皿を10分以上室温で必要とされる場合37℃で5 min（最小）インキュベーション℃、5％CO 2の媒体を再平衡化するが可能になります。 注：メディアは長時間生理以下の温度（37℃）に達した場合筋繊維は死んでしまう。 小型ボアピペット、transfe使い方rが新しいあらかじめ温めておいた皿（3つの連続した​​洗浄の最初）に単一筋繊維を生きる。すべてを一度に筋繊維のバルクを転送する代わりに、個々にそれぞれの筋線維を処理します。必要に応じて、37℃で、培地を再平衡化するために10〜15分間、5％のCO 2。 2回以上またはすべての死んだ筋繊維や破片が削除されるまで、ステップ3.3を繰り返します。我々は、適切なクリーンアップのために、少なくとも3つの連続洗浄をお勧めします。 注意：ショートとハイパーは、顕微鏡の光の下で契約通りに死んだ筋繊維が表示されます。 37℃単一筋繊維をインキュベート℃、前培養培地への切り替えには、少なくとも1時間、最後の洗浄の皿（のみDMEM）中で5％のCO 2。これは、筋繊維が血清の非存在下でin vitroでの条件に調整することができます。我々は血清富栄養培地繊維の縮小を増加に筋繊維の即時文化を発見した。 1時間後、新たな温めた皿にするか、適切なカルチャ形式に筋繊維を転送下流のアプリケーションに応じて。高血清培地で培養繊維は衛星細胞の活性化を可能にします。あるいは、血清またはニワトリ胚抽出物の異なる濃度を使用することもできます。一日おきに培地を変更します。 4。下流アプリケーション 免疫染色 。ライブ筋繊維を単離中に固定されており、任意の時点で染色することができる。免疫は、フローティングと基板に接続された筋線維の両方で実行することができます。フローティング筋繊維を染色した場合、別の溶液から筋繊維を転送するために小口径のガラスピペットを使用しています。あるいはまた、それはすべての手続きを通して同じ井戸に筋繊維を維持し、ガラスピペットを使用してソリューションを追加/削除することが可能である。これは同様に筋線維の除去になりますように、標準の吸引を避ける。簡単に言えば、完全に培地を除去し、5分間温めておいた4％パラホルムアルデヒド（PFA）でフィックス筋繊維。 PBSで数回洗浄する。インキュベーションPFAのバックグラウンド染色を最小限に抑えるために、PBS中1％グリシンまたは他の標準的な焼入れソリューションのTE筋繊維。必要に応じて、PBSで5分間洗浄続く10分間PBSにTriton X-100を0.1％筋繊維を透過。室温で1時間以上、好ましくは一晩4℃でのブロッキング溶液中で繊維（10％ウマ血清、0.1％トリトンX-100、1％NaN）をインキュベート代替ブロッキング溶液は、目的の抗体に応じて、使用されるかもしれません。 5分間PBSで一度洗浄します。 4℃、室温で1時間または一晩ブロッキング溶液で希釈した適切な一次抗体とインキュベート任意の未結合抗体を除去するためにPBSで洗浄あたり5分で繊維を3回洗浄します。室温で45分〜1時間のための適切な二次抗体を用いてインキュベートします。 PBS中で洗浄あたり5分で3回洗浄する。 1 mg / mlのDAPIで核を対比染色する。浮遊繊維を染色した場合、顕微鏡に適したガラススライドに各繊維を転送します。 PBSまたは媒体の任意の過剰を削除します。メディ取付適用ええと、その後カバースリップを追加します。蛍光顕微鏡下で筋線維を可視化するために進んでください。 EDLの筋繊維に代表免疫については、 図4を参照してください。強力な固定剤を使用する代替染色手順はVermaさん、M. ら 11 Wosniak、交流ら 12に記載されている。 オリゴヌクレオチドまたはプラスミド一過性トランスフェクション 。ライブ筋繊維は、関心のある特定の遺伝子/ sのプラスミドまたはsiRNAをトランスフェクトすることができます。 siRNAを使用する場合は、二重トランスフェクションは、効率的な遺伝子ノックダウンすることをお勧めします。我々は、分離から8時間後の最初のトランスフェクションを行うことをお勧めします。トランスフェクション後の六時間は、新鮮な培地と交換してください。 siRNAトランスフェクションのために、私たちは、50nMの最終濃度を使用して開始を示唆している。遺伝子発現のノックダウンは、RNA抽出によって、または好ましくは免疫染色によって分析することができます。 ウイルス感染 。ライブ筋繊維の感染は可能ですが、ここではセルの発生率死はオリゴフェクションに比べて高く、感染効率は、筋肉の状態や年齢に応じて可変とすることができる。例えば、そのまま大人になってから筋肉の筋線維は、宿主感染13,14に対する保護バリアを提供することが示されている基底膜が存在するために、ウイルス感染に特に非応答性である。彼らは静止（非有糸分裂）細胞に感染することができますので、レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターよりも優先されます。ウイルス感染の場合は、マトリゲル被覆された皿やプレート上で培養繊維へのお勧めで、筋繊維が最初の24時間のためのメディアの状態に調整することができます。 イメージングを生きる 。筋繊維のイメージングは特に時間がかかり、37℃、5％CO 2のチャンバーを備えた顕微鏡を必要と住んでいます。単一のサテライト細胞の挙動を評価する際に便利です。この技術を用いて行われた作業は、衛星細胞の異質性の発見のために尽力されているとそのbehaを勉強する繊維上vior（15と16）。