Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Toutes les expériences ont été traitées selon l'Université d'Ottawa de la réglementation des soins aux animaux et de manutention. Voir le tableau 1 pour une vue d'ensemble du protocole. 1. Avant de commencer l'isolement Préparer les solutions suivantes: Type de collagénase 0,2% I dans du DMEM (Dulbecco modifié Eagle moyen; taux élevé de glucose, L-glutamine avec 110 mg / ml de pyruvate de sodium). Pendant deux muscles EDL préparer 2 ml de Collagenease 0,2% dans du DMEM. Filtrer la solution à travers filtre de 0,22 um. 10 min avant l'isolement, préchauffer à 37 ° C dans un bain d'eau. Aliquotes supplémentaires de la collagénase non dilué peut être congelé à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Remarque: l'utilisation du DMEM avec du pyruvate de sodium pendant toute la procédure. Fibres ne survivent pas en sodium pyruvate du milieu exempt. Médias à laver (utiliser pour effectuer tous les lavages). Supplément DMEM avec 1% de pénicilline / streptomycine. Filtre à 00,22 um filtre avant de l'utiliser. Milieux de culture myofibrille. Supplément DMEM avec 20% de FBS, extrait d'embryon de poulet 1% et 1% de pénicilline / streptomycine. Filtrer à travers filtre de 0,22 um avant utilisation. Matrigel plats revêtus. Pour les fibres de la culture pour la période de temps prolongée, nous vous recommandons d'utiliser comme substrat Matrigel revêtement. Pour préparer des plats revêtus de Matrigel, décongeler une aliquote de Matrigel à 4 ° C pendant une nuit. Le lendemain, diluer Matrigel 1:10 dans du DMEM. Gardez Matrigel à 4 ° C en tout temps et éviter les changements brusques de température car cela va créer des cristaux microscopiques dans la solution de Matrigel résultant de revêtement irrégulier. Placez les plats à revêtir sur glace. Manteau de plats avec un volume juste assez pour couvrir la surface. Laissez-le reposer pendant 1 min. Supprimer complètement le Matrigel restes. Laissez la vaisselle sécher à 37 ° C pendant au moins 3 heures avant de l'utiliser ou de la nuit. Remarque: aliquotes de Matrigel diluée peut être réutilisée plusieurs fois à des fins de revêtement si elle est conservée à 4 et deg; C. Enfin, n'oubliez pas de nettoyer la station de microscope et des outils de dissection avec de l'éthanol à 70%. Pendant deux isolements EDL (une souris) préparer cinq boîtes de Pétri en plastique (60 * 15mm) comme suit: Quatre plats pour l'isolement (1 pour le muscle de dissociation, 3 pour les lavages en série). Tous les plats doivent être enduites de sérum de cheval (HS) pour éviter de se fixer aux fibres musculaires en plastique. Pour manteau, pipette 3 ml de sérum de cheval dans chaque boîte, tourbillon pour permettre même revêtement, enlever le sérum de cheval et laissez-le sécher le plat pendant au moins 30 min. Ajouter 4 ml de DMEM à chaque plat. Garder la vaisselle à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur avant de l'utiliser. Note: le sérum de cheval peut être réutilisée plusieurs fois, si maintenue stérile. En variante, une solution de HS 10% dans du DMEM peut être utilisée pour enrober des plats. Utilisez de la vaisselle SH enduits à travers l'ensemble du protocole et de la culture des fibres musculaires lorsque des conditions variables. Un plat sera utilisé pour fibres musculaires après l'isolement de la culture. Alttailles de paraboles ernative ou formats peuvent être utilisés pour la culture finale des fibres musculaires en fonction des applications en aval. Cependant, nous ne suggérons pas tailles de paraboles de plus de 60 * 15mm. Myofibres peut être maintenu en suspension pendant plus de 96 heures avant la contraction se produit hyper. Pour les temps de culture plus longues, nous recommandons l'utilisation de Matrigel plats revêtus ou plaques. Pour une isolation en fibre (2 EDL), préparer deux stériles Pipettes Pasteur: une pipette de grand calibre pour la manipulation des muscles et une pipette de petit calibre pour la manipulation myofibrille. Utiliser un stylet de diamant pour couper chaque pipette en verre à la longueur souhaitée et polir la chaleur pour lisser les bords de la pipette. À l'aide de la flamme, la courbe de la pointe de la pipette de petit calibre. Cela aidera à la manipulation des fibres simples. Flamme à stériliser. Enrober chaque pipette avec HS avant utilisation. 2. Dissection des muscles et la digestion Aux fins de ces expériences, âgées de 8 semaines SV129, Pax7 creer CKLR; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) et Myf5-Cre; Rosa26YFP ont été utilisés. Vaporiser membres postérieurs avec de l'éthanol à 70%. Pin de l'animal (le visage) pour une plaque de support pour avoir une meilleure idée de la patte arrière au cours de la procédure. À l'aide de ciseaux, couper à travers toute la longueur de la branche et exposer le muscle sous-jacent. Retirez la peau ainsi que les cheveux ou la fourrure (figure 1A). Avec une paire de ciseaux fins, couper à travers l'aponévrose mince sans endommager les muscles sous-jacents. Visuellement localiser l'EDL. L'EDL se trouve dans la loge antérieure de la patte arrière juste en dessous du muscle tibial antérieur (TA) du muscle. Avec l'aide de deux pinces, exposer les tendons distaux. Couper les tendons distaux (à la fois de la TA et EDL) avec de fortes ciseaux à ressort Cohann-Vannas. Avec l'aide d'une pince tenir à la fois l'assistance technique et les muscles EDL par leurs tendons et les muscles tirez délicatement jusqu'à vers l'extrémité proximale. À ce stade, vous devriez être en mesure de voir clairementle muscle EDL juste en dessous du muscle TA. Maintenant, séparez les EDL dans le muscle TA en tirant les deux tendons dans des directions opposées (figure 1B). Évitez d'étirer le muscle EDL lors de cette opération car cela pourrait endommager les fibres musculaires. Exposer le tendon EDL. Pour mieux visualiser le tendon proximal il peut être utile à ce stade d'enlever le muscle TA. Il peut également aider à couper un peu de tissu conjonctif autour du genou (figure 1C). Couper le tendon proximal et retirez délicatement l'EDL (figure 1D). En maintenant le muscle par ses tendons, de le transférer à 2 ml de solution de collagénase préalablement préparé. Incuber à 37 ° C dans un bain d'eau. Remarque: pour l'isolation en fibre de succès, il est important d'isoler l'EDL à partir de tendon au tendon afin que l'intégrité myofibrille est maintenue. Étapes de 2,3 à 2,9 peut être réalisée sous un microscope à dissection. Alternativement, l'utilisation d'un magnification verre peut également aider à avoir une meilleure vue sur les muscles. Répétez les étapes 2,3 à 2,9 pour isoler l'EDL seconde. Transfert de l'EDL deuxième dans le même tube. Pour éviter la digestion inégale, l'isolement de l'EDL seconde devrait être terminé au plus 5 minutes après le premier. Note 1: temps d'incubation peut être nécessaire d'ajuster en fonction de l'activité de la collagénase. D'incubation plus ou moins long peut être nécessaire en fonction de la taille, l'âge et / ou la fonction musculaire (par exemple, les muscles ont besoin de temps fibrotiques plus digestion). Note 2: Si l'examen par satellite comportement des cellules dans des conditions de quiescence, l'agitation pendant le temps de digestion musculaire peut activer les cellules satellites 10. Pendant le temps de la digestion, de vérifier régulièrement le muscle pour éviter de digestion. Arrêtez la digestion lorsque les muscles commencent à se détendre et fibres musculaires sont visibles. Pour arrêter la digestion, transférez les deux muscles dans un plat préchauffé Petri avec 4 ml de DMEM (dissociatisur le plat). Utiliser la pipette taille de gros calibre pour effectuer cette opération. Remarque: éviter de digestion excessive du muscle car cela entraîne inévitablement l'isolement des fibres musculaires contractées hyper. 3. Seule fibre musculaire de dissociation et de la Culture Pour libérer myofibrilles, utilisez la pipette en verre de grand diamètre pour rincer le muscle avec un milieu chaud jusqu'à ce que les fibres naturellement commencent à être libéré. Ne pas triturer le muscle car cela entraînera inévitablement des fibres nuisibles. Effectuer cette opération et les étapes suivantes sous un microscope à dissection. Continuer jusqu'à ce que la libération myofibres le nombre désiré est atteint. Si la capsule est tenue à la température ambiante pendant plus de 10 min permettre un min 5 (minimum) d'incubation à 37 ° C, 5% CO 2 à rééquilibrer le milieu. Remarque: si le fluide atteint des températures inférieures physiologique (37 ° C) pendant une période prolongée fibres musculaires mourront. En utilisant la taille de petit calibre pipette, transfer vivent fibres musculaires simples à un nouveau plat préchauffé (premier des trois lavages consécutifs). Tenez chaque myofibrille individuellement au lieu de transférer en vrac des fibres musculaires à la fois. Si nécessaire, incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 10-15 min à rééquilibrer le milieu. Répétez l'étape 3.3 pour 2 ou plusieurs fois jusqu'à ce que toutes les fibres musculaires mortes et les débris sont enlevés. Nous recommandons au moins trois lavages consécutifs pour bon nettoyage. Remarque: myofibres morts apparaissent le plus court et hyper contracté sous la lumière du microscope. Incuber fibres musculaires simples à 37 ° C, 5% CO 2 dans le plat dernier lavage (DMEM uniquement) pendant au moins une heure avant de passer au milieu de culture. Ceci permet de s'adapter aux fibres musculaires les conditions in vitro en l'absence de sérum. Nous avons constaté que la culture immédiate des fibres musculaires dans un milieu riche sérique augmente rétrécissement de la fibre. Après une heure, le transfert fibres musculaires à un nouveau plat préchauffé ou au format de culture appropriéen fonction de la demande en aval. Fibres Culture en milieu sérique élevé pour permettre l'activation des cellules satellites. En variante, différentes concentrations de sérum ou d'extrait d'embryon de poulet peuvent également être utilisés. Changer le milieu tous les deux jours. 4. Applications en aval Immunomarquage. Myofibres Live peuvent être fixées et colorées à aucun moment au cours de l'isolement. Immunofluorescence peut être effectuée à la fois sur myofibres flottantes et le substrat attenante. Si la coloration fibres musculaires flottants, utiliser une pipette en verre de petit diamètre pour transférer des fibres musculaires d'une solution à l'autre. Alternativement, il est possible de garder fibres musculaires dans le même puits pendant toute la procédure et ajouter / supprimer des solutions à l'aide d'une pipette en verre. Éviter l'aspiration standard comme cela se traduira par la suppression des fibres musculaires ainsi. En bref, supprimer complètement milieu de culture; myofibres fixes dans du paraformaldéhyde à 4% préchauffé (PFA) pendant 5 min. Largement laver à plusieurs reprises PBS. Incubationmyofibres te de 1% de glycine dans du PBS ou d'autres solutions de trempe classiques pour minimiser la coloration de fond PFA. Si nécessaire, perméabiliser myofibrilles avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min suivi d'un lavage de 5 min dans du PBS. Incuber fibres dans une solution de blocage (10% de sérum de cheval, 0,1% de Triton X-100 à 1% NaN) pendant 1 heure à la température ambiante ou de préférence une nuit à 4 ° C. D'autres solutions de blocage peuvent être utilisés, en fonction de l'anticorps d'intérêt. Laver une fois dans du PBS pendant 5 min. Incuber avec l'anticorps approprié primaire dilué dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Laver fibres 3 fois à 5 min par lavage dans du PBS pour éliminer tout anticorps non lié. Incuber avec l'anticorps secondaire approprié pendant 45 min à 1 h à température ambiante. Laver 3 fois à 5 min par lavage dans du PBS. Contre les noyaux avec 1 mg / ml DAPI. Si la coloration des fibres flottantes, transférer chaque fibre à une lame de verre convenable pour la microscopie. Enlevez l'excès de PBS ou moyen terme. Appliquer de montage medieuh, puis ajouter la lamelle. Procédez de visualiser myofibres sous un microscope à fluorescence. Voir la figure 4 pour immunofluorescence représentant myofibres EDL. Procédures de coloration alternatives utilisant fortes fixateurs sont décrits dans Verma, M. et al. 11 et Wosniak, AC et al. 12. Oligonucléotide ou un plasmide transfection transitoire. Myofibres Live peuvent être transfectées avec le siRNA plasmide ou gène spécifique / s d'intérêt. Lors de l'utilisation de siRNA, transfection double est recommandée pour les inactivation génique efficace. Nous vous suggérons de réaliser la transfection première fois après 8 heures de l'isolement. Six heures après la transfection, remplacez-le par du milieu frais. Pour transfection de siRNA, nous vous suggérons de départ en utilisant une concentration finale de 50 nM. Knockdown l'expression des gènes peut être analysé par extraction de l'ARN ou de préférence par immunomarquage. L'infection virale. Infection des fibres musculaires vivantes est possible, bien que l'incidence de la cellulela mort est plus élevée qu'avec la transfection oligo et l'efficacité d'infection peut être variable en fonction des conditions de muscle et de l'âge. Par exemple, intactes myofibrilles musculaires adultes sont particulièrement sensibles non à une infection virale due à la présence de la lame basale qui a été montré pour fournir une barrière protectrice contre l'infection hôte 13, 14. Les vecteurs lentiviraux sont préférables aux vecteurs rétroviraux car ils peuvent infecter des cellules quiescentes (non mitotique). En cas d'infection virale, il est conseillé de fibres culture sur un plat recouvert de Matrigel ou une plaque et laisser myofibres s'adapter aux conditions médias pour les 24 premières heures. Vivez l'imagerie. Vivez l'imagerie des fibres musculaires est particulièrement fastidieux et nécessite un microscope équipé d'un 37 ° C, 5% CO 2 chambre. Il est utile pour évaluer le comportement des cellules satellites uniques. Les travaux effectués à l'aide de cette technique a été déterminant pour la découverte de l'hétérogénéité des cellules satellites et d'étudier leur comporVior sur les fibres (15 et 16).