איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

1. מיצוי של חלבון מטרה מנוירונים ביפוקמפוס ראשוניים מתורבתים לפני קציר חלבון אנדוגני מתאים ביפוקמפוס עיקריים, להכין מאגר תמוגה (LB; טבלת 1) עם מעכבי פרוטאז. עד 10 מ"ל של חיץ תמוגה, להוסיף פתרון 0.1 מ"ל phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF) לריכוז סופי של 10 מ"מימ, ולהוסיף לוח קוקטייל מעכב פרוטאז 1. הכן N-ethylmaleimide (nem) פתרון (טבלה 1) מאבקת lyophilized. מתמוסס בעדינות EtOH 100% בטמפרטורת חדר (RT). תמיד להכין תמיסה טרייה ליום של ניסוי nem. הבא לשלב חיץ תמוגה וnem. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון nem 2M לצינור טרי 50 מיליליטר חרוטים. הוסף LB 20 מ"ל מעל הראש, ומהר LB המקום + nem (ריכוז סופי של 50 מ"מימ) על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C כדי לערבב באופן מלא למשך 5 דקות. תמיד להוסיף פתרון השנייה ראשונה וLB nem / EtOH, כדי לערבב 2 כמו שצריך. הסר נוירונים בתרבית מהחממה ומקום על * קרח. בעדינות להסיר תקשורת הסלולרית, ולשטוף בעדינות פעמים עם פוספט הקר נאגר מלוח (PBS) 1x. הוסף 300 מ"ל של LB + nem 50mm לבאר הראשונה של נוירונים ביפוקמפוס, ותאי סריטות באמצעות מרים תא פנוי. איסוף lysate התא, ואז לפרוק את lysate לתוך הבאר הבאה של אותה הקבוצה. לגרד תאים בתוך 2 גם באמצעות מרים התא, לאסוף, ולחזור להשתמש גם שלישי, אם יש צורך להתרכז lysate נוסף. איסוף lysate תא לטרום מקורר (על קרח), צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. חזור על השלב 1.4 באמצעות 100 μl של LB + nem 50mm לאסוף כל lysate תא נותר. תעבור lysate תא סך דרך מזרק מד 26 ½ 5-6 פעמים כדי לסייע בתמוגה מכאנית, נזהר שלא לפוצץ בועות לפתרון. אחד במקום יכול sonicate עבור 15 שניות על קרח, אם ציוד זמין. Nutate lysate תא ל≥ 30 דקות ב 4 ° C. להבהיר את ליסה התאטה ידי צנטריפוגה XG ב 16000/30 דקות, כדי תאי גלולה בלתי lysed חומר ניקוי וחומר מסיס. האיסוף פינה lysate תא (supernatant) בצינור חדש מראש מקורר 1.5 מ"ל על קרח. חזור על פרוטוקול קציר לכל הקבוצות של תאים. ריכוז חלבון במידה כל דגימות lysate באמצעות BCA assay, ולנרמל את עוצמת הקול של כל דגימות lysate מקבוצות של תאים יש חלבון כולל שווה בדיוק, עם מינימום מומלץ של 500 מיקרוגרם. למעלה כל הדגימות עם LB + nem 50mm לסך הנפח 500 μl. הוסף 1-5 מיקרוגרם של נוגדן ראשוני נגד חלבון המטרה לכל אחת ממדגם lysate. Nutate דגימות נוגדנים lysate המעורבות הלילה ב 4 ° C. * נוירונים ביפוקמפוס עכברוש ראשוניים צריכים להיות מתורבתים בצפיפות של כ 250.000 תאים / היטב בצלחת 6-ובכן, בתקשורת סרום נטולה המכילה תוסף B27 עצבי, כפי שתואר לעיל 5, וגדל לתשוקהאורך ד של זמן, בדרך כלל 14-16 ימים, במבחנה (DIV) כדי להשיג בגרות. מינימום של 500 מיקרוגרם של חלבון כולל מומלץ immunoprecipitate הצלחה וbiotinylate חלבון עצבי יעד, אשר בדרך כלל דורש 2-3 בארות של צלחת 6-כן. 2. משקעים של חלבון מטרת נוגדן בכריכה לפני החשתי ולשתק חלבון המטרה, להתכונן סלארי 50% מחלבון A או חרוזי sepharose, חלבון ה-G-מצופים. באופן ספציפי, להוסיף ≥ 60 μl של חרוזי sepharose לדגימה לצינורות 1.5 מ"ל, ולהבטיח כי כל הדגימות יש כמויות שווות של חרוזים. חרוזים מגנטיים מתאימים גם אם הציוד זמין. הוסף נפח שווה של תרחיף 50% לכל דגימת הנוגדנים lysate, וnutate ל≥ 1 שעה ב 4 ° C. 3. Acyl-Exchange ביוטין: מחשוף hydroxylamine (שינקין) בעת ביצוע שלב 2.2, להכין מספר הצינורות עם חיץ תמוגה (LB) של דיPHS fferent. PH הוא חשוב מאוד לשלבים הבאים ותמיד צריך להיות מותאם משתמש במד pH. הכן 2 מ"ל של pH 7.2 LB לדגימה, ו0.5 מ"ל של הצפה מחמירה לפי מדגם (טבלה 1). גם להכין LB ​​מ"ל 0.5 + nem 10mm לדגימה, כמו בשלבים 1.1-1.3. הוסף טבליות מעכב פרוטאז PMSF ולכל מאגרי תמוגה, כמו בשלב 1.1. Hydroxylamine (שינקין) הוא סוכן עצמת צמצום, מחשוף שמPalmitate מcysteines נדרש לbiotinylation (איור 1), והמחדל של מחשוף HAM משמש כשליטה שלילית. פיצול כל דגימה של חרוזים לשתי דגימות, אחד השמטת צעד המחשוף HAM (-HAM), ואחד כולל את צעד HAM (+ HAM). כדי לנרמל לפירוק חלבונים הנגרם על ידי טיפול שינקין, אחד צריך לפצל כל דגימה לשלישים, עם 1/3 מהחרוזים המשמשים לבקרת HAM-, ונותרו 2/3 המשמשים לטיפול HAM +. הכן 1 נוסף.5 צינורות מ"ל על קרח, שכותרתו שליטת HAM-עבור כל מדגם. בעקבות צעד 2.2, עדינות סרכזת חרוזים של כל הדגימות בדקות XG 0.5 / 1 ב 4 ° C (צנטריפוגה במהירות זו, משך זמן, וטמפרטורה לכל יתר השלבים, אלא אם כן צוין אחר), הנח את הצינורות על קרח, להסיר את supernatant, ו מחדש להשעות את החרוזים ב600 μl של LB + nem 10mm. לאחר מחדש מתלים-חרוזים של הדגימות במאגר תמוגה + nem 10mm, לאסוף באופן מיידי 200 μl של slurry lysate של החרוזים של המדגם, והזרמה למדגם שהצינור של HAM-על קרח. הוסף 300 μl נוסף של LB + nem 10mm למדגם HAM-, ו100 μl נוסף מדגם HAM + עבור סכום כולל של 500 μl בכל דגימה. דגירת הצינורות למשך 10 דקות על קרח. Re-להשעות (לשטוף) HAM-ודגימות HAM + בעדינות עם חיץ מחמיר 0.5 מ"ל, למדגם. לבצע שלב זה במהירות, כמו דגירת SDS עוד תגרום להסרה של נוגדן מאוגד מחרוזים. לשטוף בעדינות את כל הדגימות שלוש פעמים ב0.5 מ"ל / מדגם LB של pH 7.2, וספין למטה בין הכביסות שכן ב3.2b צעד. בעת ביצוע שלב 3.5, להכין חיץ HAM (טבלה 1). הוסף נפח המתאים של פתרון hydroxylamine לצינור חדש, כדי להשיג ריכוז סופי של 1M בנפח של pH 0.5 מ"ל LB 7.2 + לדוגמה, הם. תמיד להכין את החיץ הטרי ליום של ניסוי HAM. הוסף 0.5 מ"ל / מדגם של pH 7.2 LB קטעים מכל בשר חזיר, ו0.5 מ"ל / מדגם של חיץ HAM לכל דגימות HAM +. Nutate כל הדגימות לשעה 1 בטמפרטורת חדר (RT). אל תחרוג משעה 1. 4. Acyl-Exchange ביוטין: תיוג ביוטין-BMCC בעת ביצוע שלב 3.6, להכין 2 מ"ל של pH 6.2 LB לפי מדגם (טבלה 1), כמו בשלב 3.1. הנח את pH 6.2 LB על קרח עד הצורך. גם להכין פתרון מניות של ביוטין-BMCC (1 טבלה) מייד לפני השימוש. תשקול את exactly 2.1 מ"ג של ביוטין-BMCC, לאסוף בצינור מ"ל 1.5, ומתמוסס בעדינות sulfoxide דימתיל המ"ל 0.5 (DMSO) על ידי נחת על פלטפורמה מתנדנדת RT, כדי להשיג ריכוז 8mm (לא משתמש בפיפטה כדי לשבור את האבקה ). לאחר השלב 3.6 הושלם, לשטוף בעדינות את החרוזים בעבר במאגר תמוגה pH 6.2, כדי להסיר חיץ HAM שיורית. הסר את supernatant ולמקם את הדוגמות על קרח. ביוטין-BMCC היא מולקולת ביוטין מצומדת maliemide שיש זיקה גבוהה לקבוצות thiol חופשיות של cysteines (איור 1). בעת ביצוע השלב 4.2, להכין 0.5 מ"ל של הצפת ביוטין-BMCC (טבלה 1) לפי מדגם, בריכוז עבודה בין 0.5 מיקרומטר עד 5 מיקרומטר. ריכוזים העולים על 5 מיקרומטר צפויים להרוות את חלבון המטרה 6, ובדרך כלל לא צריך להיות חריגים, אולם זה עשוי להשתנות בהתאם לחלבון המטרה הרצויה. הוסף 0.5 מ"ל של חיץ ביוטין-BMCC לכל דגימה, וnutate בדיוק לשעה 1 ב4 &מעלות; ג אל תחרוג משעה 1. 5. Elution של חלבון מטרת ביוטין מצומדות וSDS-PAGE לאחר השלב 4.3 הושלם, לשטוף בעדינות את כל הדגימות פעם אחת בחומציות LB 6.2. שמור את כל הדגימות על קרח בין כביסות. הסר מאגר לדוגמא SDS 2x ללא סוכני הפחתה (טבלה 1) מ-20 ° C אחסון ולהפשיר לאט על קרח. לשטוף בעדינות דגימות שלוש פעמים בחומציות LB 7.5 + PMSF / מעכבים, ולשמור על קרח בדגימות בין כביסות. הסר את supernatant מהכביסה השלישית, משאיר את חרוזי pelleted בתרחיף עם חיץ שנותר בתחתית של תחתית. טבול פיפטה עם טיפ קטן בקוטר (טיפ טעינת ג'ל או קצה פיפטה P2 מספיק) לחלק התחתון ביותר של הצינור דרך slurry, ולאסוף במהירות כל חיץ שנותר, נזהר שלא לקחת את כל חרוזים. תוספת המאגר לדוגמא SDS 2x עם DL-Dithiothreitol (DTT) כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מ"מ. להוסיף40-50 μl של מאגר לדוגמא 2x + DTT 5mm לכל דגימה. במידת הצורך, מערבולת החרוזים לערבב לחלוטין עם חיץ המדגם, וחובצה מייד במהירות גבוהה כדי לאסוף את כל החרוזים בגלולה, שקועים בחיץ מדגם. מרתיח את כל הדגימות ל10 דקות ב 75-80 ° C. תן דוגמאות מגניבות RT ל≥ 10 דקות על גבי ספסל, וצנטריפוגה XG ב 16000/3 דקות לגלולה לחלוטין את החרוזים. הוסף נפח מלא של חלבון eluted (supernatant) מכל דגימה לנתיב אחד בתוך הג'ל polyacrylamide מתאים למערב סופג, באמצעות 7 SDS-PAGE. לארגן את כל הדגימות כך שeluent-HAM השליטה וeluent HAM + ליחיד מדגם מנוהלים באופן מיידי סמוכים זה לזה במהלך SDS-PAGE (איור 2). בעקבות SDS-PAGE, להעביר לPVDF או קרום ניטרוצלולוזה. 6. מערבי סופג ואיתור של palmitoylation של חלבון מטרה ברגע שיושלם שלב 5.6, לשטוף את הממברנהפעמים בטריס-נאגר מלוח (TBS 1x) למשך 10 דקות על פלטפורמת נדנדה בRT. הכן מאגר חסימה כדי לחסום תיוג לא ספציפי על ידי שקילה החוצה אלבומין בסרום שור (BSA), כדי להשיג משקל של 3% בנפח של TBS 1x + Tween-20 0.05% (TBS-T) כי די בכך כדי להטביע את הקרום באופן מלא . לstreptavidin סופג, תמיד לחסום עם BSA ולא אבקת חלב. חסום את הקרום לשעה 1 בRT על פלטפורמת נדנדה. הכן את פתרון נוגדן של TBS-T + BSA 0.3%. הוסף נוגדן HRP-streptavidin מחדש ב1 מ"ג / מ"ל ​​במים מזוקקים, בדילול 1:5,000-1:10,000. לאחר השלב 6.2 הושלם, לשטוף את הממברנה פעם אחת בTBS-T למשך 10 דקות, ואז דגירת הקרום בפתרון נוגדן streptavidin על פלטפורמת נדנדה לאו לשעה 1 בRT, או הלילה ב 4 ° C. שטוף את הממברנה שלוש פעמים בTBS-T למשך 10 דקות על פלטפורמת נדנדה. על מנת לאתר את אות palmitoylation, לחשוף את הארת HRP שימוש כימיערכת המצע iluminescent. כדי לנרמל את רמות palmitoylation לכמות החלבון של עניין שimmunoprecipitated, להפשיט את קרום חיץ באמצעות הפשטת כתם מערבי לדקות 5-10 על פלטפורמת נדנדה בRT. חזור על שלבים 6.1-6.4 באמצעות נוגדן הראשוני נגד החלבון של ריבית ששמש במקור לimmunoprecipitation. לכמת palmitoylation של החלבון של עניין באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, ולנרמל את רמות palmitoylation לכמות חלבון immunoprecipitated.