Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

1. Extractie van Target Eiwit van gekweekte primaire hippocampale neuronen Voor de oogst endogene eiwit van primaire hippocampale cellen, bereid een Lysis Buffer (LB; tabel 1) met proteaseremmers. Aan 10 ml lysisbuffer, voeg 0,1 ml oplossing phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) tot een eindconcentratie van 10 mM en voeg 1 protease inhibitor cocktail tablet. Voorbereiden N-ethylmaleimide (NEM) oplossing (Tabel 1) van gevriesdroogd poeder. Voorzichtig los op in 100% EtOH bij kamertemperatuur (RT). Altijd bereid NEM oplossing vers voor de dag van het experiment. Vervolgens combineren lysisbuffer en NEM. Voeg 0,5 ml van 2M oplossing NEM een verse 50 ml conische buis. Voeg 20 ml LB top boven, wordt snel LB + NEM (eindconcentratie van 50 mM) op een schommelende platform bij 4 ° C volledig mengen gedurende 5 minuten. Voeg altijd NEM / EtOH oplossing eerst en LB tweede terdege de twee te mengen. Verwijder gekweekte neuronen van incubator en plaats op ijs *. Verwijder cellulaire media en voorzichtig tweemaal wassen met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x. Voeg 300 ml LB + 50 mM NEM tot de eerste bron van hippocampale neuronen, en schraap cellen met behulp van een wegwerp cel lifter. Verzamel de cellysaat, vervolgens lozen het lysaat in de volgende bron van die groep. Schraap cellen in de tweede put met behulp van de cel lifter, verzamelen, en herhaal behulp van een derde goed, als nodig is om verder te concentreren het lysaat. Verzamel cellysaat in een voorgekoeld (op ijs), 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal stap 1.4 met gebruikmaking van 100 pi LB + 50 mM NEM alle resterende cellysaat verzamelen. Pass totale cellysaat door middel van een 26 ½ meter spuit 5-6 keer om te helpen bij de mechanische lysis, zorg dat de niet bellen blazen in de oplossing. Men kan in plaats Sonificeer 15 sec op ijs, wanneer apparatuur beschikbaar. Nutate cellysaat voor ≥ 30 min bij 4 ° C. Verduidelijking van de cel Lysate door centrifugeren bij 16.000 xg / 30 min, om pellet niet-gelyseerde cellen en detergent onoplosbaar materiaal. Verzamel gewist cellysaat (supernatant) in een nieuwe pre-gekoelde 1,5 ml buis op ijs. Herhaal oogst protocol voor alle groepen van cellen. Maatregel eiwitconcentratie in alle lysaatmonsters met BCA assay en normaliseren het volume van alle lysaatmonsters van groepen van cellen precies gelijke totale eiwitten hebben met een aanbevolen minimum van 500 ug. Vul alle monsters met LB + 50 mM NEM tot 500 ul totaal volume. Voeg 1-5 ug primair antilichaam gericht tegen het doeleiwit aan elk lysaat monster. Nutate het antilichaam-lysaat gemengd monsters overnacht bij 4 ° C. Primaire rat hippocampale neuronen worden gekweekt bij een dichtheid van ca. 250.000 cellen / putje in een 6-wells schaal, in een serumvrij medium met een B27 supplement neuronale, zoals eerder beschreven 5 en gekweekt voor het verlangend tijd, meestal 14-16 dagen in vitro (DIV) tot rijpheid bereiken. Een minimum van 500 ug totaal eiwit wordt aanbevolen om succesvol immunologisch en een doelwit eiwit neuronale die gewoonlijk Hiervoor zijn 2-3 putjes van een 6-wells schaal biotinyleren. 2. Precipitatie van antilichaam gebonden doeleiwit Voor neerslaan en immobiliseren van een doeleiwit Bereid een 50% suspensie van proteïne A of proteïne G sepharose beklede kralen. Specifiek voeg ≥ 60 pl sepharose korrels per monster naar 1,5 ml buisjes, zodat alle monsters evenveel kralen hebben. Magnetische kralen zijn ook geschikt als het materiaal beschikbaar is. Voeg een gelijk volume van 50% slurry aan elk antilichaam-lysaat monster en nutate ≥ 1 uur bij 4 ° C. 3. Acyl-Biotine Exchange: hydroxylamine (HAM) Cleavage Hoewel het uitvoeren van stap 2.2, stelt een aantal buizen met lysis buffer (LB) diandere kleur heeft pH's. De pH is zeer belangrijk voor deze stappen en dienen te worden bijgesteld met behulp van een pH meter. Bereid 2 ml LB pH 7,2 per monster, en 0,5 ml van strenge Buffer per monster (Tabel 1). Bereid ook 0,5 ml LB + 10 mM NEM per monster, zoals in de stappen 1,1-1,3. Voeg PMSF en protease inhibitor tabletten alle lysis buffers, zoals in stap 1.1. Hydroxylamine (HAM) is een krachtig reductiemiddel, waarvan splitsing van palmitaat uit cysteines vereist voor biotinylering (figuur 1), en het weglaten van het HAM splitsing dient als negatieve controle. Splitsen elk monster van kralen in twee monsters, een weglaten van het HAM klieving (-HAM) en een onder de HAM stap (+ HAM). Normaliseren van eiwitafbraak door HAM behandeling moet men elk monster gesplitst in drieën met 1/3 van de korrels voor de HAM-control en de overige 2/3 voor de + HAM behandeling. Bereid extra 1.5 ml buizen op ijs, aangeduid als de HAM-controle voor elk monster. Na stap 2,2 voorzichtig alle monsters 'beads gecentrifugeerd bij 0,5 xg / 1 min bij 4 ° C (centrifuge met deze snelheid, duur en temperatuur voor alle overige stappen tenzij anders vermeld), de buizen op ijs, de bovenstaande vloeistof, en resuspendeer de kralen in 600 ul van LB + 10 mM NEM. Na opnieuw schorsing van de monsters 'parels in lysisbuffer + NEM 10 mM, onmiddellijk verzamelen 200 ul lysaat-kraal het monster slurry, en lozing in dat monster-HAM buis op ijs. Een extra 300 pi LB + 10 mM NEM de HAM-sample en een extra 100 ul het HAM + monster voor een totaal van 500 pi in elk monster. Incubeer de buizen gedurende 10 minuten op ijs. Re-schorten (wassen) de-HAM en + HAM monsters voorzichtig met 0,5 ml strenge buffer, per monster. Snel uitvoeren van deze stap, omdat een langere incubatie SDS zal resulteren in de verwijdering van gebonden antilichaam van hetkralen. Voorzichtig wassen alle monsters driemaal in 0,5 ml / monster van LB pH 7,2, en spin neer tussen wasbeurten als in stap 3.2b. Hoewel het uitvoeren van stap 3.5, stelt een HAM buffer (tabel 1). Voeg het juiste volume van hydroxylamine oplossing naar een nieuwe buis, tot een eindconcentratie van 1 M bereiken in een volume van 0,5 ml LB pH 7,2, per + HAM monster. Altijd de voorbereiding van de HAM buffer vers voor de dag van het experiment. Voeg 0,5 ml / monster van LB pH 7,2 tot all-HAM samples en 0,5 ml / monster aan HAM buffer om alle monsters + HAM. Nutate alle monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Neem niet meer dan 1 uur. 4. Acyl-Biotine Exchange: Biotine-BMCC Labeling Hoewel het uitvoeren van stap 3.6, bereiden van 2 ml LB pH 6,2 per monster (Tabel 1), in stap 3.1. Plaats de LB pH 6,2 op ijs tot gebruik. Meteen ook een voorraadoplossing bereid van biotine-BMCC (tabel 1) voor gebruik. Weeg exactgevoerd 2,1 mg biotine-BMCC, verzamelen in een 1,5 ml buis, en zachtjes in 0,5 ml Dimethylsulfoxide (DMSO) op te lossen door het toestel op een schommelstoel platform bij kamertemperatuur, tot 8mm concentratie (gebruik geen pipet te breken van de poeder te bereiken ). Zodra stap 3.6 is voltooid, voorzichtig een keer wassen van de beads in pH 6,2 lysisbuffer, om residueel HAM buffer te verwijderen. Verwijder het supernatant en plaats de monsters op ijs. Biotine-BMCC een maliemide geconjugeerd biotinemolecuul dat een hoge affiniteit voor vrije thiolgroepen van cysteïnes (Figuur 1). Hoewel het uitvoeren van stap 4.2, bereiden 0,5 ml biotine-BMCC Buffer (tabel 1) per monster op werkconcentratie van 0,5 uM tot 5 uM. Concentraties dan 5 uM waarschijnlijk het doeleiwit 6 verzadigen, en typisch niet worden overschreden, dit kan echter verschillen afhankelijk van de gewenste doeleiwit. Voeg 0,5 ml van biotine-BMCC buffer aan elk monster en nutate precies 1 uur bij 4 ° C. Neem niet meer dan 1 uur. 5. Elutie van biotine-geconjugeerd doeleiwit en SDS-PAGE Zodra stap 4.3 is voltooid, voorzichtig een keer wassen alle monsters in LB pH 6,2. Houd alle monsters op ijs in tussen de wasbeurten. Verwijder 2x SDS monsterbuffer zonder reducerend middel (Tabel 1) van -20 ° C opslag en langzaam ontdooien op ijs. Voorzichtig wassen monsters drie keer in LB pH 7,5 + PMSF / remmers, en de monsters op ijs in tussen de wasbeurten te houden. Verwijder het supernatant van de derde wassing, waardoor de gepelleteerde beads in een slurry met resterende buffer in de bodem van de buis. Dompel een pipet met een kleine diameter tip (een gel laad tip of P2 pipetpunt voldoende) in de bodem van de buis door de slurry, en snel verzamelen alle resterende buffer, en let niet op te nemen elke kralen. Aanvullen 2x SDS monsterbuffer met DL-Dithiothreitol (DTT) tot een eindconcentratie van 5 mM te bereiken. Toevoegen40-50 pi 2x monsterbuffer + 5 mM DTT aan elk monster. Indien nodig, vortex de korrels volledig wordt gemengd met het monster buffer, gecentrifugeerd en onmiddellijk met hoge snelheid naar alle parels in een pellet, ondergedompeld in monsterbuffer verzamelen. Kook alle monsters gedurende 10 min bij 75-80 ° C. Laat monsters koel aan kamertemperatuur gedurende ≥ 10 minuten op de bank boven, en centrifugeer bij 16.000 xg / 3 min volledig pellet de kralen. Voeg volledige volume geëlueerde eiwit (supernatant) van elk monster aan een baan op een polyacrylamide gel geschikt voor western blotting, met SDS-PAGE 7. Dient alle monsters zodat het HAM-control eluent en + HAM eluent voor een monster onmiddellijk grenzend aan elkaar lopen tijdens SDS-PAGE (Fig. 2). Na SDS-PAGE, naar een PVDF of nitrocellulose membraan. 6. Western blotting en detectie van palmitoylatie van Target Protein Zodra stap 5.6 is voltooid, was het membraantweemaal in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS 1x) 10 minuten op een schommelende platform bij kamertemperatuur. Bereid een blockingbuffer niet-specifieke labeling blokkeren door weging van Bovine Serum Albumine (BSA), 3% gewicht te bereiken in een volume van TBS 1x + Tween-20 0,05% (TBS-T) die voldoende is om volledig onderdompelen membraan . Voor streptavidine blotting, altijd blokkeren met BSA en niet poedermelk. Blokkeren membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schommelende platform. Bereid een oplossing van antilichaam TBS-T + 0,3% BSA. Voeg Streptavidine-HRP antilichaam opgelost bij 1 mg / ml in gedestilleerd water, verdund 1:5,000-1:10,000. Zodra stap 6.2 is voltooid, het membraan eenmaal wassen in TBS-T gedurende 10 min en vervolgens incuberen van het membraan in Streptavidin antilichaamoplossing op een schommelende platform voor ofwel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Was het membraan driemaal in TBS-T gedurende 10 min op een schommelende platform. Om het detecteren palmitoylatie, bloot HRP luminescentie met een chemiluminescent substraat kit. Om te normaliseren palmitoylatie de hoeveelheid van het eiwit van belang dat werd immunologisch Strip de membraan met Western blot strippen buffer gedurende 5-10 minuten op een schommelende platform bij kamertemperatuur. Herhaal stap 6,1 tot 6,4 met het primaire antilichaam tegen het eiwit van belang dat oorspronkelijk werd gebruikt voor de immunoprecipitatie. Kwantificeren palmitoylering van het eiwit van interesse met behulp van beeldanalyse software en normaliseren palmitoylering niveaus om de hoeveelheid immunogeprecipiteerd eiwit.