שיפוע צפיפות רבה שכבתי פלמור (DGMP): שיטה חדשנית ליצירת תא בעל מספר, פיגומים להנדסת רקמות להתאמה אישית
Summary
כאן אנו מתארים אסטרטגיה ייחודית ליצירת מטריצות ביולוגיות, שכבתיות עם ממשקים רציפים בין שכבות שונות להנדסת רקמות. כגון פיגום יכול לספק סביבה להתאמה אידיאלית לתא לווסת את התנהגות על ידי רמזים ביולוגיים, כימי או מכאניים שונים
Abstract
מטריצות שונות רקמות תרבות, שבו סוגים וריכוזים של גירויים ביולוגיים (למשל גורמי גדילה, מעכבים, או מולקולות קטנות) או מבנה מטריצה (למשל הרכב, ריכוז, או נוקשות של המטריצה) משתנים במרחב, תאפשרנה מגוון רחב של חקירות באשר לשאלה כיצד משתנה אלה תשפיעו על התמיינות תאים, הגירה, ותופעות אחרות. האתגר העיקרי ביצירת מטריצות שכבתיות הוא שמירה על השלמות המבנית של ממשקי שכבה ללא דיפוזיה של רכיבים בודדים מכל שכבה 1. מתודולוגיות נוכחיות כדי להשיג זאת כוללות photopatterning 2-3, יתוגרפיה 4, functionalization5 הרציף, הקפאת ייבוש 6, 7 מיקרופלואידיקה, או צנטריפוגה 8, שרבים מהם דורשים מכשור מתוחכם ומיומנויות טכניות. אחרים מסתמכים על קובץ מצורף רציף של שכבות בודדות, דבר שעלול להוביל לdelamination של 9 שכבות </sup>.
DGMP מתגבר על בעיות אלה באמצעות צירוף צפיפות אינרטי כמו iodixanol כדי ליצור שכבות של צפיפויות שונות 10. מאז ניתן לערבב צירוף הצפיפות עם כל prepolymer או מולקולה ביו, DGMP מאפשר לכל שכבת פיגום כדי להיות מותאמת אישית. כל שעליך לעשות שינוי הריכוז של צירוף הצפיפות מונע ערבוב של שכבות סמוכות בזמן שהם יישארו מימיים. פילמור צעד אחד לאחר מוליד רב שכבתי פיגום מבני מתמשך, שבו כל שכבה יש כימית ייחודיים ותכונות מכאניות. השינוי של הצפיפות ניתן להסיר בקלות עם מספיק שטיפה ללא הפרעה של השכבות הנפרדות או רכיביהם. טכניקה זו ולכן גם מתאימה ליצירת הידרוג בגדלים שונים, צורות וחומרים.
פרוטוקול לבודת ג'ל 2D-פוליאתילן גליקול (PEG), שבה לסירוגין שכבות לשלב Rgds-350, מפורט להלן. אנו משתמשים ב PEGecause הוא ביולוגי ואינרטי. Rgds, הידבקות תא 11 פפטיד, משמש כדי להדגים הגבלה המרחבי של אות ביולוגית, והנטייה של fluorophore (אלקסה פלואוריד 350) מאפשרת לנו להבחין חזותי שכבות שונות. הליך זה יכול להיות מותאם לחומרים אחרים (למשל קולגן, hyaluronan, וכו ') וניתן להאריך לפברק ג'לי 3D עם כמה שינויים 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
DGMP היא אסטרטגיה פשוטה להכנת ג'לי multilayered שאינו מסתמך על מכשור יקר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ליצירת פיגומים באמצעות חומרים ביולוגיים אחרים, כגון קולגן וחומצה היאלורונית. מולקולות קטנות יו, למשל תא הידבקות-קידום פפטיד Rgds, ניתן קשורים לפולימר מטריקס כדי למנוע ערבוב של רמזים בין שכבות. חלבונים יכולים להיות גלומים בשכבות נפרדות ללא צורך בצימוד כימי כפי שהם, תלוי בגודל רשת מטריקס, הם פחות נוטים לנטרל באמצעות הידרוג 10. כאן נקטתי iodixanol (Nycoprep), צירוף צפיפות אינרטי, אשר בעבר שמש במשך יישומי תא קיימא. מכפילי צפיפות אחרות כמו סוכרוז ודקסטרוז יכולים לשמש גם. על ידי שינוי זמן השיקוע (לא ים), ניתן לכוונן את הממשקים בין שתי שכבות לייצר מעברי חלקים או חריפים לפי צורך (זמן ארוך יותר ליישב נותן מעברים חלקים) <sup> 10. לדוגמה, מעברים חלקים יותר בין שכבות ג'ל DGMP יכולים לשמש כדי ליצור שיפוע מתמשך של אות ביולוגית כדי ללמוד על תהליכים בתא, כגון chemotaxis.
ההשפעה של צירוף צפיפות בנוקשות ג'ל מוצגת בתרשים 5 ל15% aPEGda ג'ל; אפיון מלא יותר של נוקשות ונקבוביות כפונקציה של PEGda וריכוזי iodixanol כעת נבדקת. בעוד ריכוז PEGda בדוגמה זו הוא גבוה יחסית, נצפינו מודולוס אלסטיות 60% יותר בג'לי עם iodixanol 30% בהשוואה לג'לי בלי. השינוי בנוקשות ג'ל יכול להיות מותאם על ידי ויסות ריכוז macromer או צפיפות crosslinking.
יש לנו גם ליישם את טכניקת DGMP ליצור ג'לי multilayered 3D באמצעות polyacrylamide ומבשרי PEG 10. משנה את הריכוז או את מידת crosslinking של prepolymer מאפשר וריאציה מבנית בפיגומים, שניתן להשתמש בם כדי לחקור את התנהגות תא כגון צמיחה והגירה מקוטבות ב-3D.
לסיכום, DGMP היא טכניקה להתאמה שניתן ליישם כדי לפברק פיגומי 2D and 3D ממגוון רחב של חומרים ביולוגיים עבור מגוון רחב של יישומי מחקר ביו ובסיסיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לתמיכה מפרסי Innovator החדשים של NIH (מנהל 1DP2 OD006499-01 ל AA ו1DP2 OD006460-01 לAJE), ומלך Abdulaziz עיר למדע והטכנולוגיה (אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו מרכז מצוין בNanomedicine). ברצוננו להודות לגב 'ג'סיקה מור להערות הביקורתיות שלה על כתב היד.
Materials
| Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
| N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
| Sigmacote | Sigma | SL2 |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
| MALDI | Bruker | N/A |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
- Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
- Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
- Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
- Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
- Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
- Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
- Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
- Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
- Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
