Un protocolo simple para el agrupamiento de plaquetas mediada por<em> Plasmodium falciparum</emEritrocitos> por el VIH en un recurso pobre ajuste

1. Recogida de muestras Las plaquetas pueden activarse fácilmente a través de la temperatura, la agitación o el almacenamiento, por lo que deben ser manejados con cuidado. El uso de tubos al vacío para recoger sangre para la preparación de plaquetas es inevitable en la mayoría de las situaciones clínicas, pero se debe considerar cuidadosamente como aspiración puede potencialmente causar la activación plaquetaria. Debido al protocolo clínico utilizado en nuestro centro de investigación, las muestras se recogen cuidadosamente vacutainers citrato de sodio. No hemos tenido ningún problema con la prematura activación plaquetaria en esta o en nuestro estudio anterior 12. Recopilamos la sangre para la preparación de plaquetas a partir del grupo sanguíneo O + individuos para reducir al mínimo el grupo sanguíneo de agregación no específica de antígeno. Asimismo, los donantes no han tomado la medicación en los días 7 a 10 anteriores, se sabe que algunos medicamentos influyen sobre la función plaquetaria. 1.1 Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP) Recoge aproximadamente 5 mlde la sangre entera desde un host ingenua la malaria o 2,5 ml de sangre de CM o malaria grave (SM) de los pacientes en un vacutainer de citrato de sodio (BD número de producto 36276). Centrifugar la sangre total a 250 xg durante 10 min a temperatura ambiente. No centrifugar a 4 ° C como bajas temperaturas pueden causar que las plaquetas a agregarse. Transferir cuidadosamente el sobrenadante turbio en un tubo de 15 ml limpio. Las plaquetas son fácilmente activados por las variaciones de temperatura y choques físicos y por lo tanto debe ser manejado con cuidado. Evite sacudidas o los movimientos bruscos del tubo. Usar hematocitómetro de un Neubauer para contar y ajustar la suspensión de plaquetas a> 300 x 10 3 plaquetas / l de donantes sanos y <150 x 10 3 plaquetas / l de CM y los pacientes SM utilizando 1X tampón de fosfato (pH 7.2-7.4; PBS). Asegúrese de elegir un alto factor de dilución para facilitar el recuento de plaquetas y garantizar su exactitud. Nota: La malaria patients tienen un recuento de plaquetas reducido en comparación con los individuos sanos 16,17,18. Por lo tanto las concentraciones de plaquetas para CM y UM se ajustan de acuerdo a los recuentos de plaquetas promedio para los pacientes dentro de cada grupo de diagnóstico de la malaria. El P. falciparum fenotipo de aglutinación es común en los aislados CM y muestra una fuerte afinidad de unión por lo tanto, las concentraciones de plaquetas no afecta a la reducción de tamaño de agrupamiento o de la frecuencia ya que la concentración de plaquetas es estandarizado para todos los casos CM. 1.2 Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP) Para obtener PPP, centrifugar una parte del PRP obtenido anteriormente a 1500 xg durante 10 min. La mayoría de las plaquetas se sedimentan en la parte inferior del tubo. Tanto PRP y PPP se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta dos semanas. Lo ideal es utilizar las plaquetas frescas para el ensayo de aglutinación. Después de 8-10 días la mayor parte de las plaquetas son propensos a estar inactivo y probablemente agregada. 2. Parasite Cultura Lavar las sedimentadas pRBC tres veces con 5-10 ml de RPMI 1640 por centrifugación a 370 xg durante 5 min. Nota: en este protocolo todas las culturas empezaron a aproximadamente 1 ml de hematocrito (PCV) y se mantuvieron a 5% de hematocrito. Los cultivos se pueden iniciar con cualquier PCV de GRI y ajustarse en consecuencia con la no infectada RBC y los medios para alcanzar el hematocrito deseado. Coloque el GRP en un matraz de cultivo y el suplemento con medio de cultivo estándar de la malaria de RPMI 1640 suplementado con 25 mM de HEPES, 5% Albumax II o 10% de suero y 40 mg / ml de gentamicina para lograr un hematocrito 5%. Permeado frascos de cultivo con una mezcla de 92,5% de nitrógeno, 2,5% de oxígeno y dióxido de carbono al 5% antes de sellar e incubar. Alternativamente, el método de jarra de anaerobiosis hermético al aire de Trager-Jensen se puede utilizar. Para pRBC obtiene directamente de los pacientes, incubar su frasco de cultivo de 24 a 36 horas en un 37 ° C incubadora de CO2 al 5% para obtener parásitos maduros. NOTA: Most laboratorio y líneas adaptadas al cultivo son muy fáciles de mantener en cultivo bajo condiciones estándar. Existen técnicas simples descritas a continuación que se pueden utilizar para sincronizar las diferentes etapas de parásitos para mantener la tasa de crecimiento. Preparar un frotis de sangre delgado como se describe a continuación y examinar la maduración del parásito al microscopio óptico. 3. Thin Blood Film Slide Preparación Coloque aproximadamente 10-15 l de sangre en un extremo de un portaobjetos de vidrio esmerilado que descansa sobre una superficie plana. Toque la gota de sangre con el borde de un segundo portaobjetos hasta que la sangre se distribuye uniformemente a través del borde de la segunda corredera. Mientras mantiene la segunda diapositiva en un ángulo de 45 °, de forma rápida, pero suavemente, sin ejercer demasiada presión sobre la primera diapositiva, deslice la sangre a través de la primera diapositiva de hacer una película delgada de sangre que se distribuye uniformemente. Deje secar al aire. Sumergir el portaobjetos en metanol durante 10 seg. Deje secar al aire. Sumerja el portaobjetos en 2% Giemsa stain durante al menos 10 min. Aclarar exhaustivamente hasta que el agua salga clara. Deje secar al aire. Examine diapositiva utilizando una lente de emulsión de aceite 90-100x en un microscopio de luz 4. Purificación y sincronización de las etapas asexuales La purificación de P. madura falciparum GRP es un paso necesario para el ensayo de aglutinación. En efecto, sólo los parásitos maduros son capaces de unirse a los receptores de plaquetas, ya que es en esta etapa del ciclo de vida que los ligandos pertinentes se expresan y sobresalen de la superficie de eritrocitos infectados. Hay varios métodos para purificar y sincronizar las etapas asexuales de P. falciparum: etapas asexuales tardías pueden ser enriquecidas por gradiente de Percoll 19; magnética de células de clasificación 20 o mediante el protocolo de gelatina de sedimentación 21 se describe aquí.. Sorbitol-sincronización selecciona para las etapas de anillo 22, después de lo cual los anillos se cultivaron durante 24-26 horas para obtener estados maduros (sin need para llevar a cabo la flotación de gelatina). 4.1 Plasmagel flotación Plasmagel flotación utiliza una solución similar a gelatina para seleccionar para el peso inferior nudoso eritrocitos a permanecer en solución, mientras que las formas de anillo densos y rosetas hunden hasta el fondo. Esta técnica da hasta un 90% de pureza de los eritrocitos infectados etapa-maduros y se puede utilizar tanto para el campo y aislamientos de laboratorio. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, plasmagel flotación elimina rosetas de GRI, así como los estados inmaduros que podrían resultar en una frecuencia reducida aglutinación en las muestras con una alta frecuencia de formación de rosetas. Sin embargo, la ausencia de la formación de rosetas GRP después de plasmagel de flotación no afectaría el ensayo de formación de grumos debido a la formación de rosetas es una interacción de los eritrocitos pRBC y no infectadas, mientras que la aglutinación es pRBCs la unión mediada por las plaquetas. El ligando implicado en estos dos rasgos es diferente; con complementar principalmente receptor de CR-1 en los eritrocitos no infectados que median la formación de rosetas. Solución Gelofusine Precalentar y medianas II-libre de suero / Albumax a 37 ° C en un baño de agua. Transferir la cultura a un tubo estéril de 15 ml limpio y sedimentar las células por centrifugación a temperatura ambiente a 370 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con cuidado a fin de no perturbar el sedimento y se resuspenden las células en un volumen igual de Gelofusine y medio libre de proteínas. Transfiera la mezcla a un tubo estéril de 15 ml y se deja reposar durante 15-20 minutos en un 37 ° C incubadora o hasta una demarcación clara se puede ver entre un nivel superior e inferior. Transferir cuidadosamente la capa superior a un tubo nuevo estéril de 15 ml y añadir 10 ml de RPMI fresco. Centrifugar a 370 xg durante 5 minutos y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Evaluar fase parasitemia y de desarrollo de frotis de sangre delgado y examinar bajo un microscopio de luz como se describe en la sección 4. NOTA: Mature gama pRBC entre 60-90% de los eritrocitos infectados depending sobre la parasitemia inicial del cultivo. Para un alto porcentaje de parásitos maduros, utilice las culturas con una parasitemia inicial de ≥ 10%. 5. Ensayo de Aglutinación Utilice hematocitómetro del Neubauer para contar y ajustar la suspensión pRBC obtenido después de la flotación plasmagel a 1 x 10 8 pRBC / l. En un tubo de 1,5 ml frescos, resuspender GRP a 5% de hematocrito, naranja de acridina a 20 mg / ml de concentración final y PRP en 10% del volumen total. En lugar de naranja de acridina, culturas parásitos se pueden teñir con 25 g / ml de bromuro de etidio durante 5 min antes de su uso. Por ejemplo, para una mezcla de reacción de 200 l, añadir 10 l de GRI maduro, 20 l de 300 x 10 3 plaquetas / l de PRP de donantes sanos o 150 x 10 3 / l plaquetas de pacientes SM y 170 l de medio libre de proteínas. NOTA: La relación de las plaquetas: pRBC en las reacciones finales es 20:01. Esto es importante ya que se permite la máximaum frecuencia de agregación de una muestra que se determine. Si se agregan las plaquetas menos en los controles y luego no todos los pRBCs agrupamiento podría tener la oportunidad de agruparse. De la misma manera preparar los siguientes controles, células rojas de la sangre no infectadas y PRP, y pRBC con PPP para determinar el papel de las plaquetas en la formación de grumos pRBCs. Transferir la suspensión a un vial cónico ml con tapón de rosca 1,5-2,0. Colocar el vial con agitación suave por laminado a 10-12 rpm a temperatura ambiente. Compruebe si la formación de un grupo húmedo diapositiva preparada con la pipeta 10 l de pRBC ± mezcla de plaquetas en un portaobjetos, cubra con un vaso resbalones y examen con fluorescencia. El muestreo puede hacerse en intervalos de 15-20 min para un total de 120 min. Un grupo se considera como un conjunto de tres o más eritrocitos infectados.