の血小板媒介クランピングのためのシンプルなプロトコル<em>熱帯熱マラリア原虫</emリソース悪い設定で、>感染した赤血球

1。試料捕集血小板は簡単に温度、撹拌またはストレージを介して活性化することができ、したがって、彼らは慎重に扱われるべきである。血小板の準備のための血液を収集するバキュテイナーの使用がほとんどの臨床状況では避けられないですが、吸引力が潜在的に血小板活性化の原因となりますので慎重に検討する必要があります。我々の研究の病院で使用された臨床プロトコルのために、私たちのサンプルは慎重にクエン酸ナトリウムバキュテイナーに収集されます。私たちは、このまたは我々の以前の研究12で時期尚早の血小板活性化の問題を経験していない。我々は、非特異的な血液型抗原の凝集を最小限に抑えるために血液型O +個体からの血小板製剤、血液を採取。ドナーはまた、いくつかの薬は、血小板機能に影響を及ぼすことが知られている前の日から10日間の投薬を受けていない。 多血小板血漿の1.1準備（PRP） 約5ミリリットルを収集マラリアナイーブホストまたはクエン酸ナトリウムバキュテナー（BD製品番号36276）でCMや重症マラリア（SM）の患者からの血液の2.5ミリリットルからの全血。 室温で10分間250×gで全血を遠心分離する。 4℃遠心しないでください°Cの低温で凝集する血小板を引き起こす可能性がある。 慎重に新しい15 mlチューブに曇り清を移す。血小板は簡単に温度変化や物理的衝撃によって活性化されるので、注意して扱われるべきである。揺れやチューブのいずれかぎくしゃく動きをすることは避けてください。 健康なドナーと1Xリン酸緩衝液（; PBS pHは7.2〜7.4）を使用して、CMとSMの患者からの<150×10 3血小板/μlのために> 300×10 3血小板/μlに血小板サスペンションをカウントし、調整するノイバウアーのhaematocytometerを使用してください。血小板数を緩和し、その精度を確保するため、高希釈倍率を選択するようにしてください。 注：マラリアバッチリientsは健常16,17,18に比べて減少した血小板数を持っている。したがって、CMおよびUM用血小板濃度は各マラリア診断グループ内の患者のための平均血小板数に応じて調整されています。 P.熱帯熱凝集表現型は、CM分離株では一般的であると血小板濃度はすべてのCMのケースのために標準化されて以来、塊の大きさや周波数に影響を与えない強力な結合親和性ゆえ減少血小板濃度が表示されます。 貧血小板血漿の調製1.2（PPP） PPPを入手するには、10分間1500 xgで上記で得られたPRPの一部を遠心。血小板の大部分はチューブの底にペレット化する。 PRPとPPPの両方が、最大2週間のために4℃で保存することができます。理想的には、凝集アッセイのために新鮮な血小板を使用しています。 8-10日後最も血小板のは非アクティブ、おそらく集約である可能性が高い。 2。パラスITE文化 5分間370×gで遠心分離することにより5〜10ミリリットルRPMI 1640でペレット化PRBC 3回洗浄する。 注：このプロトコルですべての文化は、約1ミリリットルパック細胞容積（PCV）から開始し、5％のヘマトクリット値で維持。培養物は、所望のヘマトクリット値に到達するPRBCのいずれPCVから始まり、非感染RBC及びメディアに応じて調整することができる。 の25mM HEPES、5％Albumax IIまたは血清、10％と5％のヘマトクリット値を達成するために、40μgの/ mlのゲンタマイシンを添加したRPMI 1640の標準的なマラリアの培養培地で培養フラスコとサプリメントでPRBCを置きます。 シーリングとインキュベートする前に、92.5％の窒素、酸素2.5％、5％二酸化炭素の混合物で培養フラスコに浸透。あるいは、トレガ-ジェンセンの気密キャンドルジャー方法を用いることができる。 PRBCは、患者から直接得られるために、成熟した寄生虫を取得するには、5％CO 2で37℃のインキュベーター内で24-36時間、彼らの培養フラスコをインキュベート。 注：MOST研究室と文化適応ラインは、標準的な条件下で培養中に維持するために非常に簡単です。成長率を維持するために、異なる寄生虫段を同期させることができ、後述する単純な技術がある。 以下のように薄い血液塗抹標本を準備し、光学顕微鏡下で寄生虫の成熟を調べます。 3。薄い血フィルムスライドの準備平らな面に載ってすりガラスのスライドの一端に血液の約10〜15μLを置きます。 血液が均等に第二スライドの端に分散されるまで、第二スライドの端との血の一滴をタッチします。 45°の角度で二スライドを保持しながら、迅速かつ慎重に、最初のスライドにあまりにも多くの圧力を与えることなく、均等に分散されて、血液の薄膜を作成する最初のスライド全体に血をスライドさせます。乾燥した空気。 10秒間メタノールでスライドを浸します。乾燥した空気。 2％ギムザセントでスライドを浸し少なくとも10分間AIN。水がきれいに実行されるまで、広範囲にすすいでください。乾燥した空気。 光学顕微鏡で90-100xの油エマルジョンレンズを使用してスライドを調べる 4。無性段階の精製と同期成熟したPの浄化熱帯熱 PRBCは凝集アッセイに必要なステップです。確かに、唯一の成熟寄生虫は、それが関連するリガンドを発現し、感染赤血球の表面から突出していることを、このライフサイクル段階にあるように血小板受容体に結合することができる。 Pの無性段階を浄化し、同期させる方法はいくつかあります熱帯熱マラリア原虫 ：後期無性段階はパーコール勾配19により濃縮することができる、20をソートまたはゼラチン沈降21プロトコルを用いた磁気セルは、ここで説明する。ソルビトール同期は（無nのリングは、成熟段階を得るために24-26時間培養した後、リング·ステージ22のために選択されます）ゼラチン浮揚を実行するEED。 4.1原形質ゲルの浮選原形質ゲル浮選は低体重が密リングフォームやロゼットが底に沈むしながら溶液中に残存する赤血球をこぶのあるを選択するために、ゼラチンのようなソリューションを使用しています。この技術は成熟期に感染した赤血球の純度90％まで提供し、フィールド実験に分離株の両方に使用することができる。しかし、前述のように、原形質ゲル浮選はロゼットPRBCだけでなく、高ロゼット周波数にこれらのサンプル中の還元凝集周波数につながる可能性が未熟な段階を削除します。凝集は、血小板によってpRBCsバインディング媒介している間ロゼットがPRBCと非感染赤血球の相互作用であるので、原形質ゲル浮選後ロゼットPRBCの不在は、凝集アッセイに影響を与えないだろう。これら二つの形質に関わるリガンドは異なります。主にロゼットを仲介する非感染赤血球のレセプターCR-1を補完すると。 ℃の水浴中で37〜Prewarm Gelofusine液及び血清/ Albumax IIを含まない培地。 5分間370×gで室温で遠心分離することによりクリーンな滅菌を15mlチューブ、ペレット細胞に文化を転送します。 慎重に等しいGelofusineの量とタンパク質を含まない培地中でペレットを再懸濁した細胞を邪魔しないように上清を吸引除去する。 滅菌を15mlチューブに混合物を移し、明確な境界は、上部と下部のレベルの間で見ることができるようになるまで37℃のインキュベーター内で15〜20分間、または放置する。 慎重に新鮮な滅菌を15mlチューブに上位層を転送し、新鮮なRPMI 10mlのを追加します。 5分間370×gで遠心し、注意深く上清を捨てる。 薄い血液塗抹標本で寄生虫と発達段階を評価し、4章で説明したように光学顕微鏡下で調べる。 注：感染赤血球dependi 60〜90％の間で成熟しPRBC範囲文化の初期の寄生虫にNG。成熟した寄生虫の割合が高いために、≥10％の初期寄生虫と文化を使用しています。 5。アッセイを凝集 ×10 8 PRBC /μlの1に原形質ゲル浮揚後に得られたPRBCサスペンションをカウントし、調整するノイバウアーのhaematocytometerを使用してください。 新しい1.5 mlチューブ、5％ヘマトクリットで再懸PRBC、アクリジンオレンジ20μgの/ mlの最終濃度とPRPでの総容量の10％である。 代わりに、アクリジンオレンジ、寄生虫培養物は、使用前に5分間、25μgの/ mlのエチジウムブロマイドで染色することができる。 200μlの反応混合物の場合例えば、10μlの成熟したPRBC、健康なドナーまたは150×10 3血小板/ SM患者および無タンパク質培地170μLからμLからPRP用/μlの300×10 3血小板20μlのを追加します。 注：血小板の比率：PRBC最終反応では、午後8時01分です。格言ができているので、これは重要です。ウム試料の凝集周波数が決定される。少ない血小板がコントロールで追加された場合、すべての凝集pRBCsは塊にチャンスがあるかもしれません。 凝集pRBCsで血小板の役割を確認するために非感染赤血球とPRPとPPPとPRBC、同様に次のコントロールを用意しております。 1.5〜2.0ミリリットルコニカルスクリューキャップバイアルにサスペンションを移す。 室温で10-12 rpmで圧延して穏やかに撹拌下にバイアルを置きます。 スライドガラス、ガラススリップ、蛍光下調べるとカバーのPRBC±血小板ミックス10μlのピペッティングすることにより調製ウェットスライドによって塊の形成を確認してください。 サンプリングは、120分の合計15〜20分間隔で行うことができます。塊は、3つ以上の感染赤血球の集合体として考えられている。