A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van<em> Plasmodium falciparum</em>-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource

1. Monsterneming Bloedplaatjes kunnen eenvoudig worden geactiveerd door middel van temperatuur, agitatie of opslag en daarom moeten ze met zorg worden behandeld. Het gebruik van vacutainers om bloed in te zamelen voor bloedplaatjes voorbereiding is onvermijdelijk in de meeste klinische situaties, maar moet zorgvuldig worden overwogen als zuigkracht kan mogelijk leiden tot activering van bloedplaatjes. Vanwege het klinische protocol dat wordt gebruikt in ons onderzoek het ziekenhuis, zijn onze monsters zorgvuldig verzamelde in natriumcitraat vacutainers. We hebben geen problemen met vroegtijdige activering van plaatjes in deze of onze vorige studie 12 meegemaakt. Wij verzamelen van bloed voor bloedplaatjes voorbereiding van bloedgroep O + individuen om niet-specifieke bloedgroep antigen aggregatie minimaliseren. Donoren ook niet opgenomen geneesmiddel in de voorafgaande 7-10 dagen omdat sommige geneesmiddelen is bekend bloedplaatjesfunctie beïnvloeden. 1.1 Bereiding van bloedplaatjes-rijk plasma (PRP) Verzamel ongeveer 5 mlvan volbloed van een malaria-naïeve gastheer of 2,5 ml bloed uit CM of ernstige malaria (SM) patiënten in een natriumcitraat vacutainer (BD productnummer 36276). Centrifugeer de volbloed bij 250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Niet centrifugeren bij 4 ° C zo lage temperaturen de bloedplaatjes aggregatie veroorzaken. Overdracht zorgvuldig de bewolkte supernatant in een schone 15 ml buis. Bloedplaatjes zijn gemakkelijk geactiveerd door temperatuurschommelingen en schokken en moet daarom met zorg worden behandeld. Vermijd schudden of schokkerige bewegingen van de buis. Gebruik een Neubauer haematocytometer de bloedplaatjessuspensie tellen en aanpassen> 300 x 10 3 bloedplaatjes / ul voor gezonde donors en <150 x 10 3 bloedplaatjes / gl van GH en SM patiënten die 1X fosfaatbuffer (pH 7,2-7,4, PBS). Zorg ervoor dat u kiest voor een hoge verdunningsfactor om het aantal bloedplaatjes te verminderen en de juistheid ervan te waarborgen. Opmerking: Malaria patients hebben een verminderd aantal bloedplaatjes in vergelijking met de gezonde individuen 16,17,18. Daarom bloedplaatjes concentraties voor CM en de UM worden aangepast op basis van tellingen van de gemiddelde bloedplaatjes van patiënten binnen elke malaria diagnostische groep. De P. falciparum samenklontering fenotype is gebruikelijk in CM isolaten en toont een sterke bindingsaffiniteit dus de verminderde bloedplaatjes concentraties heeft geen invloed klonteren omvang of frequentie sinds concentratie van bloedplaatjes is gestandaardiseerd voor alle CM gevallen. 1.2 Voorbereiding van de bloedplaatjes-arm plasma (PPP) PPP verkrijgen centrifugeren een gedeelte van de PRP hierboven verkregen bij 1500 xg gedurende 10 minuten. De meerderheid van bloedplaatjes pellets op de bodem van de buis. Zowel PRP en PPP kunnen bij 4 ° C gedurende twee weken opgeslagen. Idealiter gebruik verse plaatjes voor de klonteren assay. Na 8-10 dagen meeste bloedplaatjes waarschijnlijk inactief en waarschijnlijk geaggregeerd. 2. Parasite Cultuur De gepelleteerde PRBC driemaal uit met 5-10 ml RPMI 1640 door centrifugatie bij 370 xg gedurende 5 minuten. Opmerking: in dit protocol alle culturen begon vanaf ongeveer 1 ml packed cell volume (PCV) en gehandhaafd op 5% hematocriet. Culturen kan worden gestart met een PCV van PRBC en aangepast met geïnfecteerde RBC en media om de gewenste hematocriet te bereiken. Plaats de PRBC in een kolf en supplement met standaard malaria kweekmedium RPMI 1640 gesupplementeerd met 25 mM HEPES, 5% Albumax II of 10% serum en 40 ug / ml gentamycine een 5% hematocriet bereiken. Permeaat cultuur kolven met een mengsel van 92,5% stikstof, 2,5% zuurstof en 5% kooldioxide voor het afdichten en incuberen. Als alternatief kan de luchtdichte kaarsenfles methode Trager-Jensen worden gebruikt. Voor PRBC rechtstreeks verkregen van patiënten, incubeer hun cultuur kolf gedurende 24-36 uur in een 37 ° C incubator in 5% CO 2 tot volwassen parasieten te krijgen. OPMERKING: Most laboratorium-en cultuur-aangepaste lijnen zijn zeer gemakkelijk te onderhouden in de cultuur onder standaard omstandigheden. Er zijn eenvoudig hieronder beschreven technieken die kunnen worden gebruikt om verschillende parasietstadia synchroniseren groei te behouden. Bereid een dunne bloeduitstrijkje zoals hieronder beschreven en onderzocht parasiet rijping onder een lichtmicroscoop. 3. Dunne Bloed Film Slide Voorbereiding Plaats ongeveer 10-15 ul van bloed aan het ene uiteinde van een matglazen dia rusten op een plat oppervlak. Raak de bloeddruppel met de rand van een tweede schuif totdat het bloed gelijkmatig wordt verdeeld over de rand van de tweede schuif. Terwijl de tweede dia in een hoek van 45 °, snel maar voorzichtig, zonder zelf te veel druk op de eerste dia, schuift het bloed over de eerste dia om een ​​dunne film van het bloed, dat gelijkmatig wordt verspreid maken. Lucht drogen. Dompel de dia in methanol gedurende 10 sec. Lucht drogen. Dompel de dia in 2% Giemsa stain gedurende tenminste 10 minuten. Spoel uitgebreid totdat het water helder is. Lucht drogen. Onderzoeken dia met behulp van een 90-100x olie-emulsie lens op een lichtmicroscoop 4. Zuivering en Synchronisatie van Ongeslachtelijke Stages De zuivering van volwassen P. falciparum PRBC is een verplichte stap voor het klonteren assay. Inderdaad, alleen volwassen parasieten kunnen binden aan bloedplaatjes receptoren is in dit levensstadium dat de desbetreffende liganden expressie en steken uit het oppervlak van geïnfecteerde erythrocyten. Er zijn verschillende methoden om te zuiveren en te synchroniseren aseksuele fasen van P. falciparum: Late aseksuele stadia kan worden verrijkt door Percoll gradiënt 19; magnetische celsortering 20 of via de gelatine sedimentatie 21 hier beschreven protocol.. Sorbitol-synchronisatie selecteren voor ring fasen 22, waarna de ringen worden gedurende 24-26 uur bij een latere fase te verkrijgen (zonder nBehoefte aan gelatine beursgang voeren). 4.1 Plasmagel Flotation Plasmagel flotatie gebruikt gelatine-achtige oplossing te selecteren op lager gewicht knobbed erytrocyten in oplossing blijft terwijl de dichte ring vormen en rozetten naar de bodem zinken. Deze techniek geeft tot 90% zuiverheid van het volwassen stadium geïnfecteerde erytrocyten en kan worden gebruikt voor zowel veld en laboratorium isolaten. Zoals eerder vermeld, plasmagel flotatie verwijderd rosette PRBC en onvolwassen stadia die kunnen resulteren in een verminderde klontering frequentie in monsters met een hoge frequentie rosetting. Echter, zou de afwezigheid van de rosette PRBC na plasmagel beursgang geen invloed op de samenklontering assay omdat rosetting is een interactie van PRBC en niet-geïnfecteerde erytrocyten terwijl klonteren is pRBCs bindend gemedieerd door bloedplaatjes. De ligand betrokken bij deze twee eigenschappen is anders, met voornamelijk een aanvulling receptor CR-1 op geïnfecteerde erytrocyten bemiddelen rosetting. Voorverwarmen gelofusine oplossing en serum / Albumax II-vrij medium tot 37 C in een waterbad. Overdracht cultuur een schone steriele 15 ml buis en pellet cellen door centrifugeren bij kamertemperatuur bij 370 xg gedurende 5 minuten. Zorgvuldig aspireren supernatant om niet de pellet en resuspendeer cellen verstoren in een gelijk volume gelofusine en eiwitvrij medium. Breng het mengsel in een steriele 15 ml buis en toe gedurende 15-20 minuten in een 37 ° C incubator of totdat een duidelijk onderscheid te zien tussen een bovenste en onderste niveau. Overdracht zorgvuldig de bovenste laag om een ​​frisse steriele 15 ml buis en voeg 10 ml vers RPMI. Centrifugeer bij 370 xg gedurende 5 minuten en zorgvuldig gooi supernatant. Beoordelen parasitemie en het ontwikkelingsstadium door dunne bloeduitstrijkje en te onderzoeken onder een lichtmicroscoop zoals beschreven in paragraaf 4. OPMERKING: Mature PRBC bereik tussen 60-90% van de geïnfecteerde erytrocyten depending op de eerste parasitemie van de cultuur. Voor hoog percentage van de volwassen parasieten, gebruik culturen met een initiële parasitaemie van ≥ 10%. 5. Klonteren Assay Gebruik een Neubauer haematocytometer aan de PRBC suspensie verkregen na plasmagel beursgang tellen en aanpassen aan 1 x 10 8 PRBC / ul. In een nieuwe 1,5 ml buis, resuspendeer PRBC bij 5% hematocriet, acridine oranje aan 20 ug / ml eindconcentratie en PRP op 10% van het totale volume. In plaats van acridine oranje, kan parasiet culturen worden gekleurd met 25 ug / ml ethidiumbromide gedurende 5 minuten vóór gebruik. Bijvoorbeeld voor een 200 ul reactiemengsel, voeg 10 ul volwassen PRBC, 20 ui 300 x 10 3 bloedplaatjes / ul voor PRP van gezonde donors of 150 x 10 3 bloedplaatjes / ul van SM patiënten en 170 gl eiwitvrij medium. OPMERKING: De verhouding van bloedplaatjes: PRBC in de uiteindelijke reacties is 20:01. Dit is belangrijk, en kan de maximum samenklontering frequentie van een monster te bepalen. Als er minder bloedplaatjes worden toegevoegd bij de controles dan niet alle klonteren pRBCs misschien de kans om klonteren te hebben. Op dezelfde manier bereiden de volgende controles; niet-geïnfecteerde rode bloedcellen en PRP en PRBC met PPP om de rol van bloedplaatjes in de pRBCs klonteren vergewissen. Breng de suspensie over een 1,5-2,0 ml conische schroefdop flacon. Plaats het flesje onder zacht schudden door walsen bij 10-12 rpm bij kamertemperatuur. Controleer vorming clump een nat-dia bereid door pipetteren 10 ui PRBC ± bloedplaatjes mix op een glasplaatje, bedekken met een glas slip en onderzoek onder fluorescentie. Bemonstering kan worden gedaan op 15-20 min. intervallen voor een totaal van 120 minuten. Een klomp wordt beschouwd als een aggregaat van drie of meer geïnfecteerde erytrocyten.