Summary

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

Published: October 08, 2012
doi:

Summary

نقدم تدفق الخلوي على أساس طريقة لدراسة تطور الخلايا T<em> في الجسم الحي</em> باستخدام الفئران وراثيا على التلاعب wildtype أو T خلفية مستقبلات الخلايا المعدلة وراثيا.

Abstract

A نظام صحي المناعي يتطلب أن الخلايا T المستضدات الخارجية الرد على حين تبقى تسامحا في تقرير المصير، مستضدات. إعادة ترتيب عشوائية من مستقبلات الخلايا T (TCR) α β ومواضع يولد مرجع خلية T مع تنوع واسع في خصوصية المستضد، سواء في تقرير المصير والأجنبية. اختيار مرجع خلال التنمية في الغدة الصعترية هو أمر حاسم لتوليد خلايا T آمنة ومفيدة. عيوب في اختيار التوتة المساهمة في تطوير اضطرابات المناعة الذاتية ونقص المناعة 1-4.

الأسلاف خلية T دخول التوتة كما نقرا thymocytes (DN) السلبية التي لا تعبر عن CD4 CD8 أو شارك في مستقبلات. التعبير عن كل من شارك وαβTCR مستقبلات يحدث في مرحلة (DP) إيجابية مزدوجة. تفاعل مع αβTCR الذاتي الببتيد-MHC (PMHC) قدم من قبل خلايا الغدة الصعترية يحدد مصير خلية توتية DP. التفاعلات تؤدي إلى تقارب عالية التحديد السلبية وeliminaنشوئها من ذاتية التفاعل thymocytes. انخفاض نتيجة التفاعلات الإيجابية تقارب في اختيار وتطوير CD4 CD8 واحد أو إيجابية (SP) خلايا T قادرة على الاعتراف المستضدات الخارجية المقدمة من MHC الذاتي 5.

يمكن دراستها اختيار الإيجابية في الفئران مع ذخيرة بولكلونل TCR (wildtype) من خلال مراقبة الجيل من الخلايا T الناضجة. ومع ذلك، فإنها ليست مثالية لدراسة اختيار السلبية التي ينطوي حذف السكان مستضد محددة الصغيرة. وقد استخدمت العديد من أنظمة نموذج لدراسة اختيار السلبية ولكنها تختلف في قدرتها على تلخيص الأحداث الفسيولوجية 6. على سبيل المثال، في المختبر من التحفيز thymocytes تفتقر إلى البيئة الغدة الصعترية التي تشارك عن كثب في الاختيار، في حين إدارة مستضد خارجي المنشأ يمكن أن يؤدي إلى غير محددة حذف thymocytes 7-9. حاليا، أفضل الأدوات لدراسة في الجسم الحي هي اختيار السلبية الفئران التي تعبر عن transgenic TCR محددة لمستضد الذاتية الذاتي. ومع ذلك، وتتميز العديد من النماذج الكلاسيكية المعدلة وراثيا من قبل TCR المبكرة التعبير عن سلسلة TCRα المعدلة وراثيا في مرحلة DN، مما أدى إلى اختيار سابق لأوانه السلبية. وقد وضعت مختبرنا النموذج CD4 HY، وهو ما يعبر عنه في مشروط HY المعدلة وراثيا TCRα في مرحلة DP، مما يسمح لاختيار سلبية تحدث أثناء الانتقال إلى DP SP كما يحدث في الفئران wildtype 10.

هنا، نحن تصف تدفق الخلوي على أساس بروتوكول لفحص الغدة الصعترية اختيار الإيجابية والسلبية في نموذج الفأر HY CD4. في حين اختيار سلبية في الفئران CD4 HY هو الفسيولوجية للغاية، ويمكن أيضا أن تطبق هذه الأساليب لغيرها من النماذج المعدلة وراثيا TCR. سنقدم أيضا الاستراتيجيات العامة لتحليل إيجابي في اختيار ذخيرة بولكلونل ينطبق على أي تلاعب الفئران وراثيا.

Protocol

الرجوع إلى الشكل 1 مخطط شامل للبروتوكول التجريبية. 1. تشريح مكان الصلب شبكة العقيمة الشاشة إلى 60 × 15 مم طبق بتري. وهناك حاجة وحدة واحدة لكل عينة الأنسجة. <li style=";text-align:right;d…

Representative Results

في الفيزيولوجية نماذج المعدلة وراثيا والفئران WT TCR، واختيار الإيجابي يبدأ في مرحلة DP مشرق قبل أن ينتقل إلى مرحلة DP مملة بعد اللقاء مستضد. thymocytes DP مملة ثم أدخل CD4 CD8 + الانتقالية المرحلة الصغرى قبل أن يصبح CD4SP أو thymocytes CD8SP (الشكل 2B). و…

Discussion

ويمكن استخدام بروتوكول المعروضة هنا لدراسة اختيار الإيجابية والسلبية في غير المعدلة وراثيا والفئران TCR TCR المعدلة وراثيا. هذا البروتوكول يصف تلطيخ من المستضدات السطحية. لمزيد من التحليل للآليات الجزيئية، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لأداء تلطيخ الخلايا. نستخدم العلوم …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر بينغ تشانغ على مساعدته التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (MOP-86595). TAB هو محقق جديد CIHR والباحث AHFMR. ويدعم QH من قبل على منحة دراسات عليا CIHR كندا – الدكتوراه ومنحة دراسية لAIHS بدوام كامل. ويدعم SAN بواسطة منحة دراسات عليا II الملكة اليزابيث. ويدعم AYWS بواسطة منحة دراسات عليا لNSERC – الدكتوراه.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
HyClone Hank’s balanced salt solution Thermo Scientific SH30030.02
Metal mesh screens Cedarlane CX-0080-E-01
Petri dishes (60 x 15 mm) Fisher Scientific 877221
Syringes (3 ml) BD Biosciences 309657
Conical tubes (15 ml) Sarstedt 62.554.205
Microscope Zeiss – Primo Star 415500-00XX-000
Hemocytometer Hausser Scientific 3110
96-well plate Sarstedt 82.1582.001
Multichannel pipette Fisherbrand 21-377-829
Fetal calf serum PAA A15-701
Phosphate buffered saline Fisher Scientific SH3025802
Sodium azide IT Baker Chemical Co. V015-05
FcR blocking reagent Clone 2.4G2
Anti-mouse HY TCR eBioscience XX-9930-YY* Clone T3.70
Anti-mouse CD4 eBioscience XX-0042-YY* Clone RM4-5
Anti-mouse CD8α eBioscience XX-0081-YY* Clone 53-6.7
Anti-mouse CD24 eBioscience XX-0242-YY* Clone M1/69
Anti-mouse TCRβ eBioscience XX-5961-YY* Clone H57-597
Anti-mouse CD69 Biotinylated eBioscience 13-0691-YY* Clone H1.2F3
Anti-mouse CD5 Biotinylated eBioscience 13-0051-YY* Clone 53-7.3
Streptavidin eBioscience XX-4217-YY*
Flow cytometer BD Biosciences – FACS Canto 338962
FACS tubes BD Biosciences 352052
Flow cytometry analysis software TreeStar – Flowjo FlowJo v7/9
HyClone RPMI – 1640 medium Thermo Scientific SH30027.01

*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

References

  1. Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
  2. Liston, A. Gene dosage–limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
  3. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
  4. Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
  5. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
  6. McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
  7. Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
  8. Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
  9. Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
  10. Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
  11. Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
  12. Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
  13. Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
  14. Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
  15. Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
  16. Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
  17. Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
  18. Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
  19. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  20. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
  21. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  22. Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  23. Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
  24. Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
  25. Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
  26. Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
  27. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  28. Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
  29. Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  30. Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
  31. Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
  32. Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).

Play Video

Cite This Article
Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (68), e4269, doi:10.3791/4269 (2012).

View Video