Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

1. Préparation de plats ECM Culture enrobées ou Lamelles Préparer la solution mère en dissolvant ECM ECM substrat dans du PBS (Dulbecco saline tamponnée au phosphate, Invitrogen, 14040-133 #). Filtrer à l'aide d'une seringue 0,2 mm filtre (VWR, # 28145-495) et le gel en aliquotes à -80 ° C. Diluer la solution mère ECM dans du PBS à la concentration souhaitée. Pour MaxGel, diluer dans du DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Invitrogen, 11995-065 #). Si immunofluorescence sera effectuée, stériliser 12 lamelles de verre circulaires mm (VWR, # 89015-724) par trempage dans de l'éthanol et laisser sécher à l'air. Cela devrait être fait dans la hotte laminaire stérile. Si immunofluorescence ne sera pas effectuée passez à l'étape 1.5. Lieu stérilisés lamelles dans chaque puits d'une plaque à 24 puits (Corning, # 3526). Ajouter 0,5 ml de solution diluée de substrat dans chaque puits de plaque à 24 puits et incuber à température ambiante pendant 3 heures. Aspirer la solution ECM et laver three fois dans du PBS. Aspirer PBS et l'utiliser immédiatement ou enveloppés dans du parafilm et conservés à 4 ° C pendant 2 semaines. 2. Préparation des outils de dissection Sylgard plaques avec du charbon ajoutée sont préparés selon le protocole du fabricant. Le fond noir résistant de ces plaques fournit un support pour mettre le doigt sur l'embryon et la couleur offre un bon contraste qui facilite la visualisation de l'embryon translucide. Pour préparer les plaques pèsent directement dans un bécher de tri-versez-les sur une balance 150 Référence g Un liquide 15 g Partie B et 1 g de poudre de charbon (World Precision Instruments, # SYLG184). Mélanger à l'aide d'un bâton de popsicle en bois ou abaisse-langue. Verser dans un verre en plastique ou des boîtes de 100 cm. Utilisez une torche au butane petite tenue environ 10 à 12 centimètres au-dessus des plats pour brûler les bulles. Placer les couvercles sur les plaques et laisser reposer pendant au moins 24 heures à configurer. Pour préparer les outils de dissection, insérez une goupille minuties (0,1 mm DIAMETREr) dans un porte-broche (outils fins scientifiques, # # 26002-10 et 26018-17, respectivement) aussi sur des aiguilles de calibre 26 (BD, # 309597) pliée à angle droit à l'aide d'une pince peut être utilisée comme instruments de dissection. Aiguisé étudiants Dumont # 5 Forceps (Outils Fine Science, # 91150-20) à l'aide d'une pierre à aiguiser (Beaux-outils scientifiques, # 29008-22). Stériliser tous les outils de dissection avec de l'éthanol à 70% avant l'utilisation. 3. Collecte des embryons Euthanasier la souris chronométré enceinte à 8,5 coïtum jours après conformément à la réglementation des animaux usage des comités et enlever l'utérus. Utérus Placer dans un plat de Petri en plastique avec du PBS stérile. Laver l'utérus une fois avec du PBS stérile. Sous un microscope à dissection retirez soigneusement embryon à partir deciduas en utilisant une paire de pinces. Retirer les membranes extra-embryonnaires et d'économiser pour le génotypage si nécessaire. Embryon au stade en comptant somites. Les étapes idéales pour faire des explants d'analyser cellulaire behAvior fois lors de l'élévation de neurones serait entre les 6 et 10 somites stades lorsque les plis neuraux commencent tout juste à élever et avant la morphogenèse majeur du mésenchyme crânienne a lieu. Laver embryon dans du PBS. Placer dans une plaque noire avec du DMEM Sylgard qui ne contient pas de rouge de phénol (Invitrogen, 21063-029 #). Retirer les membranes extra-embryonnaires et d'économiser pour le génotypage si nécessaire. 4. Préparation des explants Recentrer le microscope au grossissement le plus haut possible sur la zone de tête de l'embryon. Faire des coupes avec une aiguille à dissection dans chaque main. Utilisez une aiguille pour maintenir le tissu en place et l'autre pour faire des coupes. Couper la tête de l'embryon avant des rhombomères. Couper le long de la ligne médiane de la tête coupent en deux moitiés égales. Couper autour des confins de la tête et la ligne médiane. Ces réductions vont retirer la crête premigratory et de l'ectoderme de surface à la frontière extérieure etla plaque préchordale sur la ligne médiane. Le reste du tissu sera l'explant et contiendra la migration neuronale crête crânienne, mésoderme paraxial et de l'ectoderme de surface. Comme le tissu est coupé, retirer les débris disséqué de l'antenne à l'aide d'une pipette Pasteur stérile. Cela évite la confusion de l'explant avec les débris disséqués. Lavez délicatement l'explant par pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette 20 ul et pipetman. Cela permettra d'éliminer les cellules faiblement attachées et prévenir les bords dentelés sur les explants. Prenez soigneusement chaque explant dans environ 10 ul de liquide à l'aide d'une pipette 20 ul et pipetman et place au centre de la culture puits enduit. Ajouter 20 ul de milieu de culture supplémenté avec 15% de FBS pour couvrir l'explant. Plaque lieu dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (5% de CO 2, 37 ° C) pendant 1-2 heures pour permettre l'explant à fixer au fond de la boîte. Afficher périodiquement afin de s'assurer que l'explant ne sècheDépart. Lorsque l'explant a attaché, ajouter prudemment dans chaque puits 250 ul DMEM supplémenté avec 10% de FBS qui a été chauffé à 37 ° C dans un bain-marie. Une fois les explants ont attaché ils ne bougeront pas lorsque la plaque est agitée doucement sous le microscope. Retour plat pour culture de tissu incubateur. Après 24 h, les explants seront solidement attachées et les cellules commencent à émigrer. À ce moment agents pharmacologiques peut être ajouté au milieu. 48 heures après l'étalement, les cellules ont migré à partir des explants. La distance migré peuvent être visualisées et imagée. En général, nous arrêter la culture à ce point depuis explants commencent à montrer des signes de viabilité a diminué de plus longues incubations. Un colorant vital comme l'acridine orange ou bleu trypan peuvent également être utilisés pour vérifier la viabilité de l'explant. À ce stade, les images peuvent être acquises à documenter la distance et le nombre de cellules qui migrent à partir de l'explant. Alternativement, si explants ont été étalées sur des lamelles,ils peuvent être fixés et analyses immunohistochimiques réalisées pour visualiser les protéines d'intérêt. Les étapes critiques dans le protocole Couper explants d'environ la même taille. Enlever tous les débris de la plaque de dissection disséquer comme vous dissection afin d'éviter la confusion avec les débris du tissu désiré explantée. Lorsque des explants de placage dans les puits ou sur des lamelles être sûr de placer des gouttelettes de médias avec explant dans le centre de bien. Laissez suffisamment de temps pour explantation attacher avant d'inonder le puits avec les médias. Les conditions de traitement doivent être normalisées pour chaque substrat d'essai et un agent pharmacologique utilisé. Deux explants peuvent être fabriqués à partir de chaque embryon (un à gauche et un à droite du tube neural). Lors du test de migration de cellules de lignées de souris mutantes dans différentes conditions expérimentales, mettre un explant mutant dans le groupe témoin et l'autre dans le groupe traité. Dépannage Si explants ne parviennent pas à fixer, augmenter le temps alloué pour la fixation. Dans notre expérience, environ la moitié des explants de ne pas attacher et plus explants respecter plus efficacement. Si explants joindre à la périphérie du puits, ils seront difficiles à l'image. Veillez à placer dans des explants centre du puits. Idéalement explants sera approximativement la même taille. Cependant, les différences dans la taille explant peut être corrigée à l'aide d'au diamètre des explants comme un facteur de correction lorsque quanitating migrations de cellules à partir d'explants. En cas de contamination être sûr stériles conditions de travail sont utilisés. Tous les outils et les surfaces de travail doivent être stérilisés avec de l'éthanol à 70%. Pipettes et des boîtes de Petri doivent être nouveaux et stérile. Si explants se perdent lors de la dissection, de supprimer régulièrement les débris pour éviter de perdre explant. Maîtriser la dissection prend du temps et demande de la pratique. Optimal grossissement, outils de dissection tranchants et aiguilles d'aide.