Reducción de la interfaz de Bio-electrónica con Biofabrication

1. Alginato de electrodeposición Conecte una fuente de alimentación a los electrodos personalizados fabricados a través de los cables de conexión con pinzas de cocodrilo. Un óxido de indio y estaño (ITO) cubierto portaobjetos de vidrio actuará como el ánodo (electrodo de trabajo) y una lámina de platino servirá como el cátodo (contra-electrodo). Coloque los electrodos manera que la superficie ITO para ser funcionalizados se opone a la contra-electrodo y se coloca en forma vertical que se sumerge en una solución o horizontalmente de tal manera que la solución de deposición está contenida en la superficie. Preparar una solución de deposición química mediante la mezcla de alginato al 1% de alginato y el 0,5% de CaCO 3 (en peso) en agua destilada y luego autoclave la solución. Se recomienda para agitar continuamente la solución cuando no esté en uso. Sumergir los dos electrodos en la solución de deposición. El alginato utilizado puede ser marcada con fluorescencia con fluoroesferas (Invitrogen), como por Cheng et al. 14, para permitir fluorescence imágenes de la película resultante. Aplicar una densidad de corriente constante (3 A / m 2) durante 2 minutos; tensión se desplazará dentro del intervalo de 2-3 V. Desconectar el electrodo y se retira la solución no depositado. Enjuagar suavemente la película con NaCl (0,145 M) para eliminar alginato superfluo. Incubar la breve película (~ 1 minuto) en CaCl 2 (0,1 M) para fortalecer el gel. Enjuagar con NaCl (0,145 M) y se incuba en una solución deseada suplementado con CaCl 2 (1 mM). Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 1B). 2. Co-deposición de las poblaciones celulares Comunicación en alginato Una señal-emisor de cultivo celular (W3110 peso de E. coli), que se cultiva en medio LB, y un cultivo de células de la señal-receptor (MDAI2 + pCT6-LSRR – amplificador de I + pET-dsRed – kan r), que se cultiva en medio LB + 50 ug / ml cada uno de kanamicina y ampicilina, debe ser crecido durante la noche unand de re-inoculado para el crecimiento hasta una densidad óptica (a 600 nm) de 1. Ajustar la densidad óptica del cultivo celular receptor a 0.4-0.6 con LB antes de su uso. Preparar una solución de deposición química de 2% y 1% de alginato de CaCO 3, y se mezcla con cada cultivo de células en una proporción de 1:1 a una concentración final de 1% de alginato, 0,5% de CaCO 3, con las células diluidas a una densidad de aproximadamente media la densidad de cultivo. Utilizar un portaobjetos de vidrio estampada con dos electrodos ITO contenidas por un polidimetilsiloxano (PDMS) bien (preparado de acuerdo con las instrucciones Sylgard y cortar al tamaño deseado) y un electrodo de platino contador. Conectar un electrodo de ITO a una fuente de alimentación con el platino como se describe en el Procedimiento 1 (electrodeposición alginato). Sumergir los electrodos en una solución de deposición que contiene las células receptoras. Establecer el suministro de energía a una corriente constante a una densidad de 3 A / m 2, donde se define la dimensión del área superficial por el único electrodo en el que Deposition va a producir. Aplicar la corriente durante 2 minutos para permitir la co-deposición de las células en la matriz de alginato. Lavar la película como se describe en el Paso 1,5. Cambiar la conexión anódica a la segunda, el electrodo adyacente, de ITO. Repetir el procedimiento de deposición (Pasos 2,4 – 2,7), pero esta vez la introducción de la solución que contiene las células del remitente. Incubar el chip 2-electrodo que contiene células codepositado y alginato de calcio-durante la noche a 37 ° C en tampón fosfato salino (PBS) suplementado con medio LB 10% y 1 mM de CaCl 2. Después de la incubación, la imagen utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 2B). 3. El quitosano Electrodeposición Conecte el suministro de energía a los electrodos a través de pinzas de cocodrilo. Un chip de silicio recubierto de oro actuará como el cátodo (electrodo de trabajo) y una lámina de platino servirá como el ánodo (contra-electrodo). Posición de la superficie del electrodo de oro, de modo ªen ella se opone a la contra-electrodo y ambos están posicionados en forma vertical que se sumerge en una solución o horizontalmente de tal manera que la solución de deposición está contenida en la superficie. Preparar una solución de quitosano mezclando copos quitosán en agua y añadiendo lentamente HCl 2 M para disolver los polisacáridos (pH final 5,6), asegurándose de que siga el procedimiento descrito por Meyer et al. 15. Colocar los electrodos en una solución de quitosano (0,8%), sumergiendo completamente el área deseada para la deposición. El quitosano utilizado puede ser marcada con fluorescencia con 5 – (y-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidil éster (Invitrogen), como por Wu et al 8, a la imagen de la película electrodepositada por microscopía de fluorescencia.. Aplicar una densidad de corriente constante (4 A / m 2) durante 2 minutos. Tensión se desplazará dentro del intervalo de 2-3 V. Calcular la densidad de corriente como una función del área de superficie de oro del electrodo de trabajo expuesto a la Deposition solución. Enjuagar el electrodo con agua desionizada para eliminar superfluos quitosano. El chip puede ser almacenado en agua o PBS (10 mM, pH 7,0). Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 3C). 4. Electroquímica Transducción con una película funcionalizado quitosano Codepósito quitosano y glucosa oxidasa (GOx) de una solución (1% de quitosano, 680 U / ml GOx, pH 5,6) a una densidad de corriente de 4 A / m 2 sobre un electrodo de modelado de acuerdo con el Procedimiento 3 (electrodeposición quitosano). Una película de quitosano atrapado en GOx será generada. Una el electrodo tratado a un sistema de tres electrodos como el electrodo de trabajo, un alambre de platino como el contra-electrodo y Ag / AgCl como electrodo de referencia, como se describe en la Figura 4A. Sumergir los electrodos en una solución tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,0) que contenía NaCl (0,1 M). Electroquímicamente conjugar la proteína a la quitosanapelícula mediante la aplicación de un voltaje constante (0,9 V) para 60s utilizando cronoamperometría 10. Coloque el chip en tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0) y se lava durante 10 minutos en un agitador orbital para eliminar cualquier GOx sin reaccionar NaCl y no conjugada. Vuelva a colocar el sistema de tres electrodos como se describe en el paso 4.2 y sumergirse en una solución de glucosa 5 mM. Usando voltametría cíclica, barrer el potencial en una dirección positiva a 0,7 V. Utilizar una película de control que no contiene glucosa oxidasa como una comparación de la cantidad de oxidación se ve en el barrido (Figura 4B). Retirar los electrodos de la solución de glucosa y enjuague con tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0) a continuación, colocar los electrodos en un vaso de precipitados de 10 ml que contiene 8 ml de tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0). El sesgo del chip GOx funcionalizado a 0,6 V para servir como el electrodo de trabajo (Figura 4C). Añadir alícuotas de glucosa a la memoria intermedia (cada alícuota aumenta la concentración de glucosa por4 mM). Generar una curva estándar entre el actual estado de equilibrio y la concentración de glucosa para la película GOx funcionalizado quitosano. 5. La proteína enzimática funcionalización Uso de la Asamblea Utilizar un portaobjetos de vidrio con un patrón de oro adyacente y el electrodo de ITO contenida dentro de un pozo de PDMS. El sesgo el electrodo de oro con un potencial catódico para electrodepósito de quitosano como se muestra anteriormente. Enjuagar película brevemente en agua desionizada y luego PBS mediante pipeta. Añadir una solución de 3 micras azules marcadas fluorescentemente "AI-2 sintetasa" 16 (utilizando un kit de marcaje DyLight) + 100 U / ml en PBS tirosinasa. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, luego enjuagar la película con PBS. Aplicar un potencial anódico al electrodo ITO para codepósito una solución de deposición química de alginato que contiene células receptoras (como se preparó en pasos 2.1-2.2). Siga los pasos 2.3-2.6 de Procedimiento 2 (co-deposición de las poblaciones celulares en alginato). Para generarla señal transmitida (AI-2) enzimáticamente, después de aclarar las películas añadir una solución de 500 mM de S-adenosil homocisteína (SAH) en PBS, suplementado con 10% de medios LB y 1 mM de CaCl 2. Cubrir los electrodos para evitar la evaporación de la solución y se incuba durante una noche a 37 ° C. Esto permitirá una respuesta de las células del receptor mediante la generación de una proteína fluorescente de color rojo (dsRed). Electrodos adyacentes pueden ser reflejados con microscopía de fluorescencia mediante el ajuste de los filtros para capturar la fluorescencia azul de la sintetasa de AI-2 y fluorescencia roja expresado por las células del receptor codepositado (Figura 5B). 6. Los resultados representativos Impuestas las señales eléctricas pueden crear microambientes localizados (por ejemplo, los campos y gradientes) cerca de una superficie del electrodo y estos estímulos pueden desencadenar el auto-ensamblaje de los polisacáridos como el alginato y el quitosano para depositar una película de hidrogel en la superficie del electrodo. Debido a que tsu transición sol-gel se produce en la superficie del electrodo, la película resultante se electroaddressed, con su geometría que coincida con el modelo de electrodos (Figuras 1B, 3C). Películas biocompatibles tales como alginato y quitosano proporcionar superficies que pueden ser funcionalizados con componentes biológicos. Uso de alginato, poblaciones únicas de células se han codepositado en direcciones separadas. Evidencia de su electroaddressment se observa en la interacción entre el emisor y el receptor población celular. La molécula autoinductora-2 (IA-2) se difunde desde las células del remitente y es absorbido por las células del receptor, lo que resulta en la expresión de la proteína dsRed rojo fluorescente (Figura 2A). En la Figura 2B, fluorescencia roja se observó sólo en el electrodo donde se tratan los receptores. Los grupos amina presentes en quitosano se proporcionan con la capacidad de respuesta pH requerido para la electrodeposición así como una superficie adecuada para funcionalización. Nosotrosutilizado estas propiedades únicas por vía electroquímica conjugar la enzima glucosa oxidasa biosensores (GOx) para electrodepositado quitosano películas. Esta enzima a continuación proporciona la capacidad para la detección de glucosa a través de una reacción enzimática (Figura 4A) que produce peróxido de hidrógeno que puede ser oxidado electroquímicamente para producir una corriente de salida. De esta manera, una señal química puede ser transducidas a la Figura eléctrica. 4B muestra que las películas en las que GOx fue electroquímicamente conjugado producir una fuerte señal anódica en presencia de glucosa en comparación con aquellas películas que no contienen GOx. Estos resultados indican GOx puede ser montado sobre una película depositada quitosano y conservará su actividad catalítica. Además, la Figura 4C muestra un paso aumento en la corriente anódica produce en respuesta a las concentraciones de glucosa en aumento. La curva estándar también presente en la Figura 4C muestra que los aumentos de paso procedió en un FAS lineal cercaHion depende de la cantidad de glucosa añadida. Estos resultados muestran que la enzima también conserva su sensibilidad a aumentar las concentraciones de glucosa en la conjugación a la película de quitosano. El límite inferior de detección no se estudió aquí como se ha caracterizado previamente para este sistema en el trabajo de Meyer et. col. También hemos demostrado la inmovilización covalente de un enzima de interés, diseñado para contener una costumbre penta-tirosina etiqueta, al quitosano en una manera controlada enzimáticamente. Específicamente, este proceso está mediada por la enzima tirosinasa. Como se muestra en el esquema en la Figura 5 (arriba), una enzima, la sintasa de AI-2 incluye una etiqueta de penta-tirosina. La tirosinasa actúa sobre la etiqueta tirosina, oxidar grupos los residuos de fenol a O-quinonas, que luego se unen covalentemente a las aminas de quitosano. Evidencia de funcionalización película quitosana con la sintetasa de AI-2 por la tirosinasa montaje se observa en la Figura 5B </strong>, donde ha sido la sintasa de AI-2 marcado con fluorescencia azul. Debido a que el AI-2 sintasa genera AI-2 a partir del sustrato S-adenosil homocisteína (SAH) en la misma forma que las células del remitente, su proximidad a las células receptoras codepositado en la presencia de HSA también causa que las células receptoras para responder fluorescentemente expresando DsRed (Figura 5A (inferior)). Fluorescencia roja de las células del receptor (Figura 5B) demuestra nuevamente la interacción entre las direcciones debido a la difusión de AI-2 a partir de una a la otra, y se indica además que las enzimas inmovilizadas para retener la actividad quitosano una vez unido covalentemente. Figura 1. Electrodeposición alginato. (A) Mecanismo de electrodeposición alginato: Como un electrodo se anódicamente sesgada, la electrólisis del agua se produce en su superficie, generando un bajo pH localizado. Partículas de carbonato de calcio reacciona con el excedentede protones, liberando cationes de calcio como las partículas se disuelven. En la presencia de cadenas de polímero de alginato, los iones se quelado en un "eggbox" red, formando un hidrogel reticulado en el electrodo. A medida que la distancia de los aumentos de los electrodos, alginato tiene una mayor tendencia a permanecer en solución debido a la presencia reducida de iones de calcio. (B) Una forma de L con patrón electrodo ITO fue utilizado para alginato electrodepósito. Un PDMS bien se fijó al electrodo para contener un alginato verde marcadas con fluorescencia (1%) y CaCO 3 (0,5%) solución de deposición. Después de electrodeposición durante 2 min. a una densidad de corriente de 3A / m 2, el hidrogel de alginato electroaddressed fue fotografiada por microscopía de fluorescencia. Figura 2. Codeposición de poblaciones celulares. (A) Esquema que muestra la interacción entre los dos E. cepas de E. coli: una población produce autoinductor-2 (IA-2), Una molécula de señalización, y se llama "AI-2 del remitente." La otra población, calificó de "AI-2 del receptor," es un reportero de la IA-2, tras la recepción de AI-2 por la difusión del remitente, que expresa la proteína fluorescente de color rojo DsRed. (B) la imagen de fluorescencia roja par de electrodos con la población de AI-2 del remitente codepositado con alginato en el electrodo de la izquierda y el AI-2 receptor de la población codepositado con alginato de electrodo de la derecha. La vista ampliada demuestra la expresión de la dsRed sólo los receptores de AI-2. Figura 3. Electrodeposición quitosano. (A) Esquema que muestra la electrodeposición dependiente del pH de quitosano. Electrólisis del agua en un electrodo de catódicamente sesgada provoca un pH localizado alta (que se muestra por un cambio de color localizada de un colorante indicador de pH cerca del cátodo en la micrografía) que estimula la transición sol-gel de quitosana en esta región. (B) Las aminas presentes en quitosano doyt pH sensibles propiedades. Por encima de un pH de 6,3 (pKa de quitosano) las aminas se desprotona, facilitando una transición de su forma soluble protonado a su forma de gel insoluble. (C) Un electrodo de oro modelado se utilizó para electrodepósito de quitosano. El electrodo, conectado catódicamente a la fuente de alimentación, se sumergió en un verde fluorescente marcado con quitosano (0,8%) solución de deposición. Después de electrodeposición durante 2 min. a una densidad de corriente de 4 A / m 2, la película electroaddressed quitosano fue fotografiada por microscopía de fluorescencia. Figura 4. Electroquímico de transducción con una película funcionalizado quitosano. (A) Esquema que muestra la configuración de un sistema de tres electrodos. Funcionalizado película quitosano sirve como electrodo de trabajo, un alambre de platino como electrodo contador y Ag / AgCl como electrodo de referencia. Electroquímico de transducción de los ingresos de glucosa a través ªe reacciones enzimáticas y electroquímico mostrado en peróxido de hidrógeno producido puede ser oxidado y se detecta en el electrodo de trabajo. (B) cíclico voltammagram (CV) en el electrodo con una película de quitosano que contiene glucosa oxidasa electroquímicamente conjugado (GOx) muestra una fuerte señal anódica en una solución de glucosa 5 mM. Una película que no contiene GOx sirvió como un control y muestra ninguna señal en la misma solución. (C) Una curva estándar entre la corriente anódica y la concentración de glucosa muestra una relación casi lineal (cada alícuota aumentó la concentración de glucosa por 4 mM y también aumentó la amplitud de la corriente en el gráfico de la inserción de una manera paso a paso). Figura 5. Funcionalización proteína utilizando ensamblaje enzimático. (A, superior) Esquema que muestra la tirosina-etiquetado como "IA-2 sintasa" está atado de forma covalente a una película de quitosano por la asamblea la tirosinasa. Los residuos de tirosina convertido en óxidozado para O-quinonas por acción tirosinasa y puede reaccionar con grupos amino sobre la película de quitosano, formando un enlace covalente. (A menos) La sintasa de AI-2 genera el AI-2 a partir de un sustrato (HSA), las células del receptor del informe generado por el AI-2 por la expresión de fluorescencia dsRed. (B) Imágenes de fluorescencia que muestra una película de quitosano en el oro, funcionalizada con azul marcado con el AI-2 sintasa. Adyacente, AI-2 células del receptor se codepositado con alginato de la OIC. Después de la adición del sustrato enzimático para el pozo y la incubación, las células del receptor AI-2 Express DsRed.