Het overbruggen van de Bio-elektronische interface met Biofabrication

1. Alginaat Elektrodepositie Sluit een voeding aan op de op maat vervaardigde elektroden via patchkabels met alligator clips. Een indium tin oxide (ITO) onder glasplaatje fungeert als anode (werkzame elektrode) en platina folie dient als kathode (tegenelektrode). Plaats de elektroden de ITO oppervlak worden gefunctionaliseerd tegen het tegenelektrode en verticaal gepositioneerd worden gedompeld in een oplossing of horizontaal, zodat de neerslagoplossing wordt opgenomen op het oppervlak. Bereid een alginaat neerslagoplossing door menging 1% alginaat en 0,5% CaCO 3 (in gewicht) in gedestilleerd water en de oplossing autoclaaf. Het wordt aanbevolen om voortdurend roeren de oplossing wanneer niet in gebruik. Dompel beide elektroden in de neerslagoplossing. De gebruikte alginaat kan fluorescent gelabeld worden met FluoroSpheres (Invitrogen), volgens Cheng et al.. 14, zodat voor fluorescence beeldvorming van de resulterende film. Breng een constante stroom dichtheid (3 A / m 2) gedurende 2 minuten; spanning zal binnen het bereik te verschuiven van 2-3 V. Maak de elektrode en verwijderen van de niet-gedeponeerde oplossing. Voorzichtig spoelen de film met NaCl (0,145 M) om overbodige alginaat te verwijderen. Incubeer de film kort (~ 1 min) CaCl2 (0,1 M) de gel te versterken. Spoel met NaCl (0,145 M) en incuberen in een gewenste oplossing aangevuld met CaCl2 (1 mM). Beeld met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 1B). 2. Codeposition van Communiceren celpopulaties in alginaat Een signaal-zender celkweek (W3110 gew E. coli), gekweekt in LB media, en een signaal-ontvanger celkweek (MDAI2 + pCT6-lsrR – amp r + PET-DsRed – kan r), gekweekt in LB media + 50 pg / ml kanamycine en elk van ampicilline, worden gegroeid overnacht eennd opnieuw geënt groei tot een optische dichtheid (bij 600 nm) 1. Pas optische dichtheid van de ontvanger celkweek tot 0,4-0,6 met LB voor gebruik. Bereid een afzetting oplossing van 2% en 1% alginaat CaCO 3 en meng met elk celkweek in een 1:1 verhouding tot een uiteindelijke concentratie van 1% alginaat 0,5% CaCO 3, met cellen verdund tot een dichtheid van ongeveer half het kweken dichtheid. Gebruik een glasplaatje patroon twee ITO elektroden bevatten met een polydimethylsiloxaan (PDMS) en (bereid volgens Sylgard instructies en gesneden tot de gewenste grootte) en een platina elektrode. Sluit een ITO-elektrode met een voeding met de platina zoals beschreven in Procedure 1 (Alginaat elektrodepositie). Dompel de elektroden in een neerslagoplossing met de ontvanger cellen. Stel de voeding een constante stroom met een dichtheid van 3 A / m 2, waarbij het ​​oppervlak afmeting wordt bepaald door de enkele elektrode waarop deposition optreden. Breng de huidige 2 minuten mogelijk te maken codeposition van de cellen in de alginaat matrix. Spoel de film zoals beschreven in stap 1.5. Schakel de anodische verbinding met de tweede, naastgelegen, ITO-elektrode. Herhaal de depositie procedure (stappen 2.4 tot 2.7), maar deze keer de introductie van de oplossing die de afzender cellen. Incubeer de twee elektroden chip met codeposited cellen en calcium-alginaat nacht bij 37 ° C in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 10% LB medium en 1 mM CaCl2. Na incubatie afbeelding met een fluorescentiemicroscoop (Figuur 2B). 3. Chitosan Elektrodepositie Sluit de voeding aan op de elektroden via krokodillenklemmen. Een gouden gecoate chip zal optreden als de kathode (werkende elektrode) en een platina folie zal dienen als de anode (tegen-elektrode). Plaats de gouden elektrode oppervlak zodat eop het zich tegen de tegenelektrode en beide verticaal gepositioneerd worden gedompeld in een oplossing of horizontaal, zodat de neerslagoplossing wordt opgenomen op het oppervlak. Bereid een chitosan-oplossing door het mengen van chitosan vlokken in het water en langzaam toe te voegen 2 M HCl aan de polysacchariden (eind pH 5,6) te ontbinden, en zorg ervoor dat de procedure die door Meyer et al.. 15 te volgen. Plaats de elektroden in een chitosan-oplossing (0,8%), volledig onder te dompelen het gewenste gebied van de depositie. De gebruikte chitosan kunnen worden fluorescent gelabeld met 5 – (en-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidylester (Invitrogen), volgens Wu et al. 8 het afbeelden van de galvanische film door fluorescentiemicroscopie.. Breng een constante stroomdichtheid (4 A / m 2) gedurende 2 minuten. Spanning verschuift in het bereik van 2-3 V. Bereken de stroomdichtheid als functie van het goud oppervlak van de werkzame elektrode blootgesteld aan deposition oplossing. Spoel de elektrode met DI-water om overbodige chitosan te verwijderen. De chip kan worden opgeslagen in water of PBS (10 mM, pH 7,0). Beeld met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 3C). 4. Elektrochemische transductie met een gefunctionaliseerd Chitosan Film Codeposit chitosan en glucose oxidase (GOX) van een oplossing (1% chitosan, 680 U / mL GOX, pH 5,6) bij een stroomdichtheid van 4 A / m 2 naar een patroon elektrode volgens stap 3 (Chitosan elektrodepositie). Een chitosan film gevangen zitten in GOX zal worden gegenereerd. Sluit de behandelde elektrode drie elektrodensysteem de werkzame elektrode een platina draad als de tegenelektrode en Ag / AgCl referentie-elektrode als zoals beschreven in figuur 4A. Dompel de elektroden in een fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) bevattende NaCl (0,1 M). Elektrochemisch conjugaat van het eiwit aan de chitosanfilm door een constante spanning (0,9 V) gedurende 60 gebruik chronoamperometry 10. De chip in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) en was 10 minuten op een schudapparaat elke gereageerd NaCl en geconjugeerde GOX verwijderen. Vervolgens plaatst de drie elektroden als beschreven in stap 4.2 en ondergedompeld in een oplossing van 5 mM glucose. Met cyclische voltametrie, vegen de potentiaal in positieve richting 0,7 V. gebruiken een controlefilm die geen glucoseoxidase als vergelijking voor de hoeveelheid oxidatie gezien in de sweep (Figuur 4B). Verwijder de elektroden van de glucose en spoel met fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0) dan de elektroden in een 10 ml bekerglas met 8 ml fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0). Bias de GOX-gefunctionaliseerde chip 0,6 V als de werkzame elektrode (Figuur 4C). Voeg aliquots van glucose naar de buffer (elke hoeveelheid verhoogt de glucose concentratie4 mm). Genereer een standaard curve tussen de steady state stroom en de glucose concentratie voor de GOX-gefunctionaliseerde chitosan film. 5. Eiwit functionalisering Met behulp van Enzymatische Vergadering Gebruik een glasplaatje patroon met een aangrenzende goud en ITO-elektrode binnen een PDMS goed. Bias de gouden elektrode met een kathodische potentieel om chitosan galvanische zoals eerder aangegeven. Spoel kort film in DI-water en daarna PBS met een pipet. Voeg een oplossing van 3 pM blauwe fluorescent gelabelde "AI-2 Synthase" 16 (met een DyLight labeling kit) + 100 U / mL Tyrosinase in PBS. Incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur spoel de film met PBS. Breng een anodische potentieel om de ITO-elektrode een alginaat depositie oplossing die de ontvanger cellen (zoals opgesteld in de stappen 2.1 tot 2.2) codeposit. Volg de stappen 2.3-2.6 van orde 2 (Codeposition van celpopulaties in alginaat). Voor het genereren vanhet uitgezonden signaal (AI-2) het enzymatisch na spoelen films toevoegen van een oplossing van 500 pM S-adenosyl homocysteine ​​(SAB) in PBS, aangevuld met 10% LB medium en 1 mM CaCl2. Bedek de elektroden om verdamping van de oplossing te voorkomen en overnacht incuberen bij 37 ° C. Dit zal voor een ontvanger celrespons door het opwekken van een rood fluorescent eiwit (DsRed). Aangrenzende elektroden kunnen worden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie door aanpassing van de filters met de blauwe fluorescentie van AI-2 synthase en rode fluorescentie die door de ontvanger codeposited cellen (Figuur 5B) te bepalen. 6. Representatieve resultaten Opgelegd elektrische signalen kunt gelokaliseerde micro-omgevingen (bijvoorbeeld velden en hellingen) in de buurt een elektrode oppervlak en deze prikkels kunnen de zelf-assemblage van Polysacchariden zoals alginaat en chitosan te storten als een hydrogel film op het elektrode-oppervlak te activeren. Omdat tzijn sol-gel overgang optreedt in het elektrodemateriaal de resulterende film electroaddressed met de geometrie overeenkomen met de elektrode patroon (fig. 1B, 3C). Biocompatibele films zoals alginaten en chitosan voorzien oppervlakken kan worden gefunctionaliseerd met biologische componenten. Met behulp van alginaat, hebben unieke celpopulaties is codeposited op verschillende adressen. Het bewijs van hun electroaddressment worden waargenomen tijdens de interactie tussen de zender en ontvanger celpopulatie. De molecule autoinducer-2 (AI-2) diffundeert uit de afzender cellen en wordt door de ontvanger cellen, resulterend in expressie van de DsRed rode fluorescent eiwit (Figuur 2A). In figuur 2B, wordt rode fluorescentie alleen waargenomen bij de elektrode waar de ontvangers worden aangepakt. De amine groepen aanwezig chitosan voorzien van de pH reactiesnelheid nodig galvanisch en een oppervlak voor functionalisering. Wijbenut deze unieke eigenschappen door elektrochemisch conjugeren van het biosensing enzym glucose-oxidase (GOX) om elektrolytisch chitosan films. Dit enzym verschaft de mogelijkheid voor de detectie van glucose door een enzymatische reactie (Figuur 4A) waterstof peroxide die dan elektrochemisch kan worden geoxideerd het produceren van een uitgangsstroom. Op deze wijze kan een chemisch signaal worden getransduceerd elektrisch. Figuur 4B toont dat films waarin GOX was geconjugeerd elektrochemisch een hard anodische signaal in de aanwezigheid van glucose in tegenstelling tot de films die geen GOX. Deze resultaten geven GOX kunnen worden gemonteerd op een gedeponeerd chitosan film en katalytische activiteit behouden. Bovendien Figuur 4C toont een stap toename anodische stroom in antwoord op toenemende concentraties glucose. De standaard curve ook in Figuur 4C toont de stap toe overgegaan in een bijna lineaire fashion afhankelijk van de hoeveelheid glucose toegevoegd. Deze resultaten tonen dat het enzym ook de gevoeligheid te verhogen glucose concentraties op conjugatie tot chitosan film blijft. De ondergrens van detectie is hier niet onderzocht zoals eerder is gekenmerkt dit systeem in het werk van Meyer et. al. We hebben ook aangetoond dat de covalente immobilisatie van een enzym van belang, ontworpen om een ​​aangepaste penta-tyrosine tag, om chitosan in een enzymatisch-gecontroleerde manier bevatten. Concreet wordt dit proces gemedieerd door het enzym tyrosinase. Zoals weergegeven door de regeling in fig. 5A (bovenste), een enzym, AI-2 Synthase omvat een penta-tyrosine tag. Tyrosinase werkt in op de tyrosine-tag, het oxideren van de residuen 'fenolgroepen naar O-chinonen, die covalent vervolgens binden aan chitosan's aminen. Bewijs van chitosan film functionalisering met de AI-2 Synthase door tyrosinase assemblage wordt waargenomen in figuur 5B </strong>, waar de AI-2 Synthase is fluorescent gelabeld is blauw. Omdat AI-2 Synthase genereert AI-2 van het substraat S-adenosyl homocysteine ​​(SAB) op dezelfde wijze als de zender cellen de nabijheid codeposited ontvanger cellen in de aanwezigheid van SAB veroorzaakt ook de ontvanger cellen fluorescent reageren door expressie DsRed (Figuur 5A (onderste)). Rode fluorescentie van de ontvanger cellen (figuur 5B) toont opnieuw interactie tussen adressen door de diffusie van AI-2 van een naar de ander en verder aan dat enzymen geïmmobiliseerd op chitosan behouden activiteit als covalent gebonden. Figuur 1. Alginaat elektrodepositie. (A) Mechanisme van alginaat elektrodepositie: als een elektrode wordt anodisch bevooroordeeld, elektrolyse van water ontstaat aan het oppervlak, het genereren van een gelokaliseerde lage pH. Calciumcarbonaatdeeltjes reageren met het overschotprotonen vrij calcium kationen de deeltjes op te lossen. In aanwezigheid van alginaat polymeerketens, raken de ionen chelaatvormer een "Eggbox" netwerk, waarbij een verknoopt hydrogel bij de elektrode. Als de afstand van de elektrode toe, alginaat een grotere neiging tot in oplossing blijven door de verminderde aanwezigheid van calciumionen. (B) een L-vormige patroon ITO elektrode werd ingezet om galvanische alginaat. Een PDMS goed is bevestigd aan de elektrode een groen fluorescent gelabelde alginaat (1%) en CaCO 3 (0,5%) neerslagoplossing bevatten. Na electrodepositing gedurende 2 minuten. bij een stroomdichtheid van 3A / m 2 is het alginaat electroaddressed hydrogel afgebeeld door fluorescentiemicroscopie. Figuur 2. Codeposition van celpopulaties. (A) Regeling met interactie tussen twee E. coli-stammen: Een populatie produceert autoinducer-2 (AI-2), Een signaalmolecule wordt en aangeduid als "Al-2 zender". De overige bevolking, aangeduid als "AI-2-ontvanger", is een verslaggever van AI-2; na ontvangst van AI-2 door diffusie vanuit de afzender, het drukt de rode fluorescerende eiwit DsRed. (B) rode fluorescentie beeld van de elektrode paar met de AI-2 afzender bevolking codeposited met alginaat op de linker elektrode en AI-2-ontvanger bevolking codeposited met alginaat rechts elektrode. Vergrote weergave toont de DsRed uitdrukking van alleen de AI-2 ontvangers. Figuur 3. Chitosan elektrodepositie. (A) met de regeling pH-afhankelijke electrodepositie van chitosan. Water elektrolyse bij een kathodisch voorgespannen elektrode veroorzaakt gelokaliseerde hoge pH (aangegeven door een gelokaliseerde kleurverandering van een pH-indicator kleurstof bij de kathode in microfoto) waarin de sol-gel overgang van chitosan stimuleert in dit gebied. (B) De aminen te presenteren over chitosan te geven it pH-responsieve eigenschappen. Boven een pH van 6,3 (pKa van chitosan) de amines gedeprotoneerd, waardoor een overgang van de geprotoneerde oplosbare vorm op onoplosbare gelvorm. (C) een patroon goud elektrode werd ingezet om galvanische chitosan. De elektrode kathodisch aangesloten op de voeding, werd ondergedompeld in een groen fluorescent gelabelde chitosan (0,8%) neerslagoplossing. Na electrodepositing gedurende 2 minuten. bij een stroomdichtheid van 4 A / m 2 is de electroaddressed chitosan film afgebeeld door fluorescentiemicroscopie. Figuur 4. Electrochemical transductie met een gefunctionaliseerd chitosan film. (A) Schematische met de set-up van een drie elektrodesysteem. Gefunctionaliseerde chitosan film dient als de werkzame elektrode een platina draad als de tegenelektrode en Ag / AgCl referentie-elektrode als. Elektrochemische transductie van glucose verloopt via ee enzymatische elektrochemische reacties weergegeven werden geproduceerd waterstofperoxide kan worden geoxideerd en gemeten op de werkzame elektrode. (B) Cyclische voltammagram (CV) in elektrode met een chitosan film met elektrochemisch geconjugeerde glucose oxidase (GOX) toont een sterk anodische signaal in 5 mM glucose-oplossing. Een film die geen GOX diende als controle en vertoonde geen signaal in dezelfde oplossing. (C) Een standaard curve tussen anodische de huidige en de glucoseconcentratie wordt een bijna lineair verband (elk aliquot verhoogde de glucoseconcentratie van 4 mm en verhoogde ook de huidige amplitude in de inzet grafiek in een stapsgewijze manier). Figuur 5. Protein functionalisering met behulp van enzymatische montage. (A, boven) regeling met tyrosine-tag "AI-2 Synthase" wordt covalent gebonden aan een chitosan film van tyrosinase montage. De tyrosine residuen worden oxidevan rond O-chinonen door tyrosinase actie kan reageren met aminegroepen de chitosan film, een covalente binding. (A, lager) De AI-2 Synthase genereert AI-2 van een substraat (SAB), de ontvanger cellen verslag van de gegenereerde AI-2 door DsRed fluorescentie expressie. (B) Fluorescentie beelden die een chitosan film op goud, gefunctionaliseerd met blauw-gelabeld AI-2 synthase. Naast elkaar zijn AI-2 cellen ontvanger codeposited met alginaat op ITO. Na toevoeging van de enzymatische substraat de put incubatie drukken de AI-2 cellen ontvanger DsRed.