生物电子界面衔接与Biofabrication

1。海藻酸钠电自定义制作通过补丁使用鳄鱼夹线电极连接电源。铟锡氧化物（ITO）覆盖玻片将作为阳极（工作电极）和铂片作为阴极（反电极）。所以要功能的ITO表面反对反电极和垂直定位的解决方案或水平等，包含表面上沉积的解决方案是将蘸放置电极。 蒸馏水1％海藻酸钠和0.5％，碳酸钙3（重量比）混合，然后高压灭菌解决方案，准备海藻酸钠沉积解决方案。建议的解决方案在不使用时要不断搅拌。 沉积溶液中浸泡两个电极。可使用海藻酸钠与FluoroSpheres（Invitrogen）的荧光标记的，每程等 14，允许荧光参数CE成像所产生的薄膜。 适用于一个恒定的电流密度（A / M 2）2分钟;电压范围内的转移2-3五断开电极和删除非交存的解决方案。轻轻冲洗，以去除多余的海藻酸钠薄膜与NaCl（0.145男）。 孵育氯化钙 （0.1米）的电影简短（约1分钟），以加强凝胶。冲洗与NaCl（0.145男）和孵化辅以氯化钙2（1毫米）的理想解决方案。 使用荧光显微镜（ 图1B）的图像。 2。共沉积的海藻酸钠沟通的细胞群一个信号发送细胞培养（W3110 WT 大肠杆菌 ），在LB培养基中生长，细胞培养和信号接收器“（MDAI2 + pCT6-LSRR – 放大器 ŕ+ PET-DsRed的 – 根 R），生长在LB培养基+ 50 μg/ mL的卡那霉素和氨苄青霉素，必须一夜之间长大了1ND再增长1光密度（600纳米）的接种。调整接收机的细胞培养的光密度0.4-0.6使用前的LB。 准备以1:1的比例到终浓度为1％海藻酸钠，0.5％，CaCO 3的沉积2％的海藻酸钠溶液和1％，碳酸钙3，每个细胞培养的混合，稀释至密度大约一半的细胞养殖密度。 使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）中（按到Sylgard说明，切成所需大小）和铂电极包含两层ITO电极图案的玻璃幻灯片。一个ITO电极连接到步骤1（海藻酸钠电）与铂的电源。 沉浸在电极沉积含有接收机细胞的解决方案。设定恒定电流的电源供应密度3 A / M 2，其中由单电极表面积维度定义，其中，沉积物n将发生。 套用目前为2分钟，让海藻酸钠基质细胞共沉积。 冲洗步骤1.5中所述的电影。 切换到第二，相邻，ITO电极的阳极连接。 重复的沉积过程（步骤2.4 – 2.7），但这次推出的解决方案，包含发件人细胞。 孵育2电极芯片，包含共沉积的细胞和钙海藻酸钠一夜之间在37°C间在磷酸盐缓冲液（PBS），辅以10％的LB培养基和1毫米氯化钙2。 经过孵化，图像使用荧光显微镜（ 图2B）。 3。壳聚糖电通过弹簧夹电极连接电源。金涂硅芯片将作为阴极（工作电极）和铂金箔作为阳极（反电极）。金电极表面的位置，以便日在反对反电极定位垂直蘸到一个解决方案或水平等，包含表面上沉积的解决方案。 准备入水混合壳聚糖片壳聚糖溶液慢慢加入2 M盐酸溶解多糖（最终pH值5.6），一定要遵循由Meyer 等15所概述的程序。 放置电极到壳聚糖溶液（0.8％），完全淹没沉积所需的面积。可以使用壳聚糖荧光标记5和6 – （）carboxyrhodamine 6G琥珀酰亚胺酯（Invitrogen公司），为吴等 8，荧光显微镜图像电薄膜。 申请一个恒定的电流密度（A / M 2）2分钟。 2-3范围内的电压将转向五，作为工作电极金表面面积接触到的沉积物等功能，计算电流密度n解决方案。 DI水冲洗电极以去除多余的壳聚糖。该芯片可以存储在水或PBS（10毫米，pH值7.0）。 使用荧光显微镜（ 图3C）的图像。 4。与功能化的壳聚糖膜的电化学传导共沉积的壳聚糖和葡萄糖氧化酶（GOx）从电流密度在4到图案的电极A / M 2，根据步骤3（壳聚糖电镀）解决方案（1％壳聚糖，680 U / ml的葡萄糖氧化酶，pH值5.6）。 GOX包埋壳聚糖膜将产生。 将处理后的电极作为工作电极，铂丝作为反电极，Ag / AgCl电极为参比电极，如在图4A中所述的三电极系统。 电极浸入磷酸盐缓冲溶液中含氯化钠（0.1米）（0.1米，pH值7.0）。 电化学共轭蛋白质的壳聚糖影片通过一个恒定的电压（0.9伏）使用计时10 60。 将在磷酸盐缓冲芯片（0.1M，pH值7.0）和轨道器上的10分钟，以消除任何未反应的NaCl和游离的葡萄糖氧化酶洗。 重新连接到步骤4.2到5 mM葡萄糖溶液浸泡所述的三电极系统。采用循环伏安，潜力朝着积极的方向扫至0.7 V使用控制电影，不含葡萄糖氧化酶氧化（ 图4B）扫描见过的金额比较。 从电极的葡萄糖溶液和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH值7.0）冲洗，然后放入10毫升烧杯中含有8磷酸缓冲液（0.1M，pH值7.0）电极。葡萄糖氧化酶的功能化芯片0.6 V的偏置作为工作电极（ 图4C）。 葡萄糖等份添加到缓冲区（每个等份增加血糖浓度4毫米）。 稳态电流和血糖浓度的葡萄糖氧化酶的功能化壳聚糖膜之间产生的标准曲线。 5。蛋白质功能化，利用酶大会与相邻的金载和在PDMS以及ITO电极图案，用玻片。偏见与金电极阴极电沉积壳聚糖如先前所示的潜力。 DI水，然后PBS冲洗电影简要吸管。 加入荧光标记的“AI-2合酶”16（用DyLight标签套件）+ 100 U / ml的PBS中酪氨酸酶3μM的蓝色解决方案。 在室温下孵育1小时，然后用PBS冲洗胶片。 应用ITO电极的阳极共沉积海藻酸钠沉积的解决方案，包含接收细胞（如准备步骤2.1-2.2）的潜力。按照步骤2步骤2.3-2.6（共沉积在海藻酸钠的细胞群）。 要生成传输信号（AI-2）酶，冲洗后的影片添加500μM的S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的PBS中的解决方案，辅以10％LB培养基和1mM氯化钙2。覆盖的电极，以防止溶液蒸发和孵育过夜在37°C。这将允许一个接收器细胞的反应，产生红色荧光蛋白（DsRed的）。 相邻的电极，可通过调整过滤器捕捉到的AI-2的共沉积的接收细胞（ 图5B）表示合酶和红色荧光的蓝色荧光，荧光显微镜成像。 6。代表结果施加的电信号可以创建一个电极表面附近，这些刺激可以引发的多糖，如海藻酸钠和壳聚糖凝胶薄膜作为电极表面上的沉积自组装的局部微环境（例如，域和梯度）。因为T他的溶胶-凝胶转变发生在电极表面，由此产生的电影electroaddressed与它相匹配的电极图案（ 图1B，3C）的几何。海藻酸钠和壳聚糖，如的生物相容性电影提供的表面，可与生物元件的功能。使用海藻酸钠，独特的细胞群已共沉积在不同的地址。他们electroaddressment证据后，发送者和接收者的细胞群之间的互动观察。从发件人的细胞和分子autoinducer-2（AI-2）扩散采取了由接收细胞，导致表达DsRed的红色荧光蛋白（ 图2A）。在图2b中，红色荧光观察仅在接收机解决的电极。 壳聚糖胺基提供电以及表面官能适合所需的pH值响应。我们利用这些独特的性质，电化学共轭的生物传感葡萄糖氧化酶（GOX）以电壳聚糖膜。这种酶，然后提供生产过氧化氢 ​​酶反应（ 图4A），然后可以电化学氧化，产生的输出电流通过检测葡萄糖的能力。这种方式，一种化学信号可以被转电。 图4B显示电影GOX电化学共轭在葡萄糖存在的阳极产生强烈的信号，反对那些不含有葡萄糖氧化酶的电影。这些结果表明，葡萄糖氧化酶可以组装到沉积的壳聚糖膜，并保留催化活性。此外， 图4C中产生的阳极电流响应增加血糖浓度的逐步增加。 图4C标准曲线表明，逐步增加在不久的线性FAS进行北恩上依赖的葡萄糖量增加。这些结果表明，这种酶还保留其敏感性，增加血糖浓度的壳聚糖膜后，共轭。检测下限是不是在这里学习，因为它已经本系统的特点在Meyer 等工作。等。 我们也已经证明，设计包含自定义的标签，在五酪氨酸酶控制方式，壳聚糖共价固定的一种酶的利益。具体来说，这一过程的酶酪氨酸酶介导的。所示，由图5A计划（上），这种酶的AI-2合酶包括五酪氨酸的标签。酪氨酸酶作用于酪氨酸标记，O型醌，然后共价结合到壳聚糖的胺氧化残留的酚组。 AI-2的酪氨酸酶的组装合成酶的壳聚糖膜功能化的证据是观察图5B </st荣>，其中AI-2合酶已被荧光标记的蓝色。因为AI-2合成酶底物S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的作为发件人细胞的相同的方式在产生AI-2，其接近接收细胞中存在的SAH共沉积也会使接收机细胞荧光表达DsRed的回应（ 图5A（下））。接收细胞的红色荧光（ 图5B），再次证明了由于AI-2的扩散从一个到另一个地址之间的互动，并进一步表明，酶固定化壳聚糖保留一次活动共价结合。 图1海藻酸钠电。 （一）机制海藻酸钠电：作为一个电极阳极偏颇，电解水在其表面发生，产生局部的低pH值。碳酸钙粒子反应与盈余质子，释放钙离子的颗粒溶解。离子在海藻酸钠高分子链的存在，成为螯合在的“eggbox”网络，形成了电极的交联水凝胶。海藻酸钠为增加电极的距离，有一个更大的趋势继续在溶液中，由于减少钙离子存在。 （二）使用一个L形图案的ITO电极电沉积海藻酸钠。一个硅橡胶固定在电极包含1荧光标记的绿色海藻酸（1％）和3（0.5％）碳酸钙沉积的解决方案。经过2分钟的电。在3A /米2的电流密度，的electroaddressed海藻酸钠水凝胶荧光显微镜成像。 图2。共沉积的细胞群。 （a）计划显示之间的相互作用2 大肠杆菌大肠杆菌菌株：一个人口产生autoinducer-2（AI-2），一种信号分子，被称为“AI-2发件人。”其他人口，被称为“AI-2接收机，是一个AI-2的记者收到来自该发件人的扩散AI-2后，它表达红色荧光蛋白DsRed的。 （二）左边的电极和电极与发件人人口的AI-2对红色荧光图像共沉积与海藻酸钠海藻酸钠共沉积在右边电极AI-2接收机的人口。放大视图显示只有AI-2接收机DsRed的表达。 图3壳聚糖电。 （a）计划显示壳聚糖的pH依赖型电。在阴极偏置电极的电解水导致局部的高pH值（本地化的显微阴极附近pH值指示剂的颜色变化），刺激本地区的溶胶 – 凝胶壳聚糖过渡。 （乙）胺壳聚糖提出的给我牛逼的pH响应性能。胺，pH值高于6.3（PKA）的壳聚糖去质子化，便利从质子的可溶性形式，其不溶性的凝胶形式的过渡。 （三）有图案的金电极用于电沉积壳聚糖。电极，阴极连接电源，浸入到荧光标记壳聚糖（0.8％）沉积解决方案绿色。经过2分钟的电。在电流密度为4 A / M 2，的electroaddressed壳聚糖膜荧光显微镜成像。 图4。与官能的壳聚糖膜的电化学传导。 （一）示意图显示的三电极系统设置。官能壳聚糖膜作为工作电极，铂丝为对电极和Ag / AgCl电极为参比电极。电化学传导葡萄糖收益通过日Ë酶和电化学反应产生过氧化氢可以被氧化和在工作电极检测显示。 （二）（CV）与壳聚糖含有电化学结合葡萄糖氧化酶（GOx）膜电极循环voltammagram一个5毫米的葡萄糖溶液中显示了强大的阳极信号。不含GOX A片作为对照，并没有显示任何信号在同一个解决方案。 （C）之间的阳极电流和血糖浓度的标准曲线显示附近的线性关系（每个等份增加血糖浓度由4毫米，也增加了电流幅度在分步进行的方式嵌入图）。 图5。蛋白质官能使用酶的组装。 （一，上）计划酪氨酸标签“的AI-2合酶”共价拴到壳聚糖膜酪氨酸酶的组装。酪氨酸残基成为OXIDized 为 O-醌酪氨酸酶的行动和反应可能与胺壳聚糖膜组，形成了共价键。 （，低），AI-2合酶产生AI-2从基板（SAH）;接收细胞的报告生成的AI-2 DsRed的荧光表达。 （二）黄金壳聚糖膜的荧光图像显示，用蓝色标记的AI-2合成酶功能。 AI-2接收机细胞相邻，共沉积在ITO海藻酸钠。除了酶解底物以及孵化后，AI-2接收细胞表达DsRed的。