سد واجهة الحيوية الالكترونية مع Biofabrication
Summary
توضح هذه المقالة نهج biofabrication: ترسب من المحفزات التي تستجيب السكريات في وجود أقطاب منحازة لخلق افلام حيويا والتي يمكن functionalized مع الخلايا أو البروتينات. نحن يبرهن على وجود استراتيجية مقاعد البدلاء أعلى للجيل من الأفلام، فضلا عن استخداماتها الأساسية لإنشاء السطوح biofunctionalized تفاعلية للالمختبر على واحد في رقاقة التطبيقات.
Abstract
Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission.
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.
Protocol
Discussion
إجراءاتنا إثبات الكهربي وfunctionalization من الأفلام البوليمر الحيوي، وهي عملية نحن مصطلح biofabrication. من خلال functionalization مع الخلايا والجزيئات الحيوية نخلق السطوح بيولوجي قادر على التفاعل مع بعضهم البعض وعنوان القطب يتم تجميعها عليها. الخطوة الأولى، الكهربي، تتم من خلال الجمعية المصير أثار من الجينات، والبوليمرات الحيوية الشيتوزان في دراساتنا، واستجابة لإشارة كهربائية. كما ذكر في وقت سابق يتم إنشاء معامل الحموضة والتي يمكن التحكم بها كثافة والوقت الحالي ترسيب، وتوفير رقابة إضافية على أبعاد الفيلم وخصائص 6،17. لقد وجدنا أنه يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الكثافة الحالية ومجموعات وقت ترسب الأقطاب هو مبين في الجدول رقم 1. في حين أن استخدام الأقطاب الكهربائية الأخرى غير مجدية، والتعديلات التي أدخلت على إجراء يكون ضروريا. بالمقارنة مع غيرها من التقنيات لتشكيل الفيلم عملية electrodeposiنشوئها هو بسيط وسريع وreagentless. ليست هناك حاجة للحصول على ذخيرة واسعة من معدات باهظة الثمن والتحضير شاقة. الأهم من ذلك، يمكن لعملية الصمود الانحرافات تجريبية طفيفة ويمكن أن تبدأ بسهولة أكثر في حالة حدوث مشكلة.
الشيتوزان غير قادرة على الاستجابة لتدرج درجة الحموضة الكاثودية واسعا نظرا لخصائص وظيفية مهمة الممنوحة لها من قبل على نسبة عالية من الأمينات الأولية. عند درجة الحموضة العالية (أكبر من الباكاف الحمضية لها من ~ 6.3) وdeprotonated والأمينات، ويصبح غير قابل للذوبان الشيتوزان، والسماح لتشكيل الفيلم. بعد الترسيب، وهذه الأفلام لا تزال تعلق على قطب كهربائي. ومع ذلك، فإن القدرة موجودة لdelaminate لهم اذا شئت. وهذه الأفلام لا تزال مستقرة طالما أن الرقم الهيدروجيني من الحل لا ينخفض إلى أقل من الباكاف الحمضية. المحاليل الحمضية protonate والأمينات والنفور لاحق كهرباء تضخم الجل حتى يذوب 18. هذا هو، وعملية التجميع / التفكيك هو عكسها على الطلب وألووفاء سلطان لإزالة الأفلام أودعت وإعادة استخدامها من الأقطاب الكهربائية. ملائم، في نطاق درجة الحموضة في المرحلة الانتقالية التي سول جل تجري على مقربة من تلك التي في معظم المكونات البيولوجية تعمل على النحو الأمثل. هذا يجعل عملية مثالية للإبقاء على وظيفة خلال الجمعية 6.
ومما يسهل تشكيل الجينات فيلم بواسطة التحليل الكهربائي انوديك من المياه، فضلا عن وجود كربونات الكالسيوم 7. درجة الحموضة المترجمة منخفض عند المصعد solubilizes على كربونات الكالسيوم مما يؤدي إلى إطلاق الكاتيونات الكالسيوم. وبالكلاب هذه الأيونات بواسطة الجينات، وتشكيل شبكة crosslinked على سطح القطب. الأفلام الجينات هي انعكاس لا سيما من خلال التنافس على أيونات الكالسيوم من مركبات مخلبية الأخرى مثل سيترات أو EDTA، والتي يمكن استخدامها في حل هذه الأفلام، والسماح لإعادة استخدام الأقطاب الكهربائية الأساسية. وهكذا، والأفلام الجينات هشة نسبيا عندما تعرضوا لظروف فسيولوجية لأن أيونات الكالسيوم ليالي بسهولةcavenged من المصفوفة هلام، وإضعاف بنيتها وتعزيز فيلم التبطين أو redissolution. للتغلب على هذا القيد، أدرجنا خطوة حضانة للفيلم في CaCl M 1 2 لتعزيز هلام. وبالإضافة إلى ذلك، من المستحسن أن تستكمل حل الفيلم حضانة (وسائل الاعلام الخلية، وغيرها) مع CaCl 2 في تركيز مم ميكرومتر، 500 3.
الإجراء الرئيسي الثاني هو functionalization من الفيلم المودعة لدى المكونات البيولوجية ذات الصلة. ويمكن تحقيق ذلك بطريقتين، الأولى اقتران الكهروكيميائية يجري، ووضع استراتيجية تسمح للجمعية، سريع reagentless من البروتينات مع سيطرة المكاني استثنائية 10. ومع ذلك، يقتصر functionalization في هذه الطريقة من قبل نشر كلور – الأيونات من خلال الفيلم إلى القطب، وكذلك نشر HOCL، فإن رد الفعل المتولدة وسيطة، والعودة بها الى حل. قدرة الجزيئات النشطة electrochemically لتمريرمن خلال هذا الفيلم يتيح للتنبيغ الكيميائية والبيولوجية في إشارات سهلة لقراءة الإشارات الكهربائية 15. لقد أظهرنا التيروزينات بوساطة اقتران كاستراتيجية الثاني لfunctionalization انزيم إلى الشيتوزان، أظهرت عن طريق ربط تساهمي AI-2 سينسيز. هذه الاستراتيجية تسمح للعملية functionalization أن يكون للرقابة وانتقائية – يعتمد على كاشف محددة، التيروزينات، والذي يعمل ينطوي على تمييز على البروتينات التي تحتوي على علامة التيروزين 9.
نعرض فائدة وتوافق مع الحياة المتعددة عنوان نظم من قبل تكرار المسارات الطبيعية على رقاقة. نظمت أول نحن سكان الخلية 2 (أي "المرسلين" و "استقبال") في عناوين مختلفة، وتبين أنها تفاعلت عبر الأقطاب الكهربائية المجاورة لتقديم AI-2 و توليد استجابة مضان. كما تم هذا المفهوم الذي أبدته تشينغ وآخرون. في 14 رقاقة ميكروفلويديك. نحن تحاكي أيضا التفاعل، ولكنها تستخدم بدلا من ذلكانزيم لتجميع AI-2 للتسليم. بهذه الطريقة، وتكرر طريقا الاصطناعية داخل الخلايا، لمنظمة العفو الدولية-2 التوليف، من خلال biofabrication وتعمل بقدر ما تفعل في حل.
في كلتا الحالتين، والتجمع من عناوين متعددة ويقدم التحدي لتجنب غير محددة ملزمة بين عناوين لأنه يجب أن يتم إدخال كل حل ترسب إلى مجموعة قطب كهربائي كامل، حتى ولو كان المقصود فقط الكهربي في عنوان واحد. ويمكن غسل لطيف حتى الآن شامل إزالة معظم المتبقي من حل غير متحيز الأقطاب الكهربائية، واستخدام تدفق في قنوات ميكروفلويديك قد تقليل مزيد من عدم الدقة. لا سيما بالنسبة للbiofabrication المجاورة الشيتوزان وعناوين الجينات، ونحن نوصي إيداع فيلم الشيتوزان الأولى، بعد هذه الخطوات مع biofunctionalization، وبعد هذا، electrodepositing الجينات. على الرغم من أننا لم نفعل ذلك هنا، وجدنا أن منع فيلم الشيتوزان مع البروتينات خامل (مثل ملك، جيش صرب البوسنة، وغيرها) يقلل إلى حد كبير غير محددة وملزمة من الجزيئات غير المرغوب فيها إلى سطح الشيتوزان لaminated.
لقد وجدنا فائدة في إنشاء أقطاب منقوشة، غالبا ما توجد في أجهزة bioMEMS، بأنها "مخططات" لترتيب معقد من الخلايا والجزيئات الحيوية. electrodeposited استخدامات الشيتوزان في الأجهزة bioMEMS يمكن أن تذهب إلى أبعد من الأمثلة المذكورة هنا 19. يمكن أن تودع الشيتوزان في هندستها الميكروسكيل المختلفة – مثل في microchannels، وعلى غير المستوية الأسطح 20،15. ويمكن أيضا أن هذه الأفلام يمكن تعديلها مع البوليمرات الأخرى ومجموعة متنوعة من البروتينات والحمض النووي، وجزيئات، والجزيئات النشطة الأكسدة لخصائص رواية 21،22،23. في أجهزة bioMEMS، وقد استخدمت الأفلام الشيتوزان لتسليم المخدرات، الأكسدة والصغيرة اكتشاف جزيء، biocatalysis، ودراسات الخلية 20،23،24،25. وبالمثل، يستخدم على نطاق واسع الجينات في شكل مصفوفة الخلايا وفخ قد تم استكشافه لاحتواء fluidic عكسها منالسكان في الخلية والأفلام immunoanalysis 26،27،28. وقد تم تلفيق الأفلام مركب للتطبيقات هندسة الأنسجة باستخدام الكهربي الجينات، التي تحتوي على مكونات مثل مع هيدروكسيباتيت لعملية زرع العظام 29.
في مظاهرات لدينا من biofabrication، لقد أظهرنا كل من التفاعلات بين المكونات البيولوجية وعبر واجهة الحيوي الالكترونية لتكون قابلة للتطبيق على حد سواء، وهذا يجلب إلى التوصل إلى احتمال دمج جميع أنواع التفاعلات لأداء متطور في إرسال الإشارات على الرقاقة. وفقا لذلك، قد biofabrication تسهيل تصنيع الأجهزة مع انخفاض "أحجام ميزة الحد الأدنى" وذلك مباشرة متابعة للتطورات المتسارعة في microfabrication، وغالبا ما بدافع من الالكترونيات الاستهلاكية. وهذا هو، ربما القادم الجيل القادم من الأجهزة في الواقع تشمل المكونات البيولوجية عطوب التي تقدم الجمعية الطبيعة الرائعة وقدرات التعرف على هيئة السلع التموينية طول أصغرليه من صنع الإنسان النظم. نحن نتصور المدى القريب التطبيقات في الأجهزة التحليلية، وأجهزة الاستشعار البيئية، والأجهزة التي تزرع في الجسم حتى حيويا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف تمويلا من اثناء اجتماع السلطة للحصول على الدعم من هذه المخطوطة من وONR، اثناء اجتماع السلطة، وجبهة الخلاص الوطني للحصول على دعم جزئي من البحوث الأساسية.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | |
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 |
| Slim Line 2″ Alligator Clips | RadioShack | 270-346 |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus | MVX10 MacroView |
| cellSens Standard | Olympus | version 1.3 |
Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR | BDH3030 |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR | VW3247 |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles |
Speciality Minerals Inc. |
100-3630-3 |
Table 2. Chitosan and alginate solution reagents.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline |
Fischer Scientific |
S271 |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich |
P4417 |
Table 3. Other solution components and buffer reagents.
| Name of the reagent | Company/Source | Catalogue number |
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 |
| “AI2-Synthase” (HGLPT) | Lab stock 16 | |
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | |
| MDAI2 + pCT6-lsrR–ampr + pET-dsRed–kanr cells | Lab stock 30 | |
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Scientific | PI-53020 |
Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents.
References
- Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
- Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
- Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
- Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
- Yang, X., Shi, X. -. W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
- Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
- Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
- Wu, L. -. Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
- Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
- Shi, X. -. W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
- Shi, X. -. W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
- de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
- Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
- Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
- Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -. C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
- Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
- Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, 61-71 (2011).
- Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
- Spinks, G. M. A novel “dual mode” actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
- Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
- Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
- Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
- Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
- Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
- Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
- Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
- Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
- Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).
