JoVE Journal > Immunology and Infection
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면역학 및 감염병학

Une nouvelle méthode de dépistage pour l'évolution dirigée des enzymes thermostables bactériolytique

Published: November 07, 2012
doi:
10.3791/4216
,
1Institute for Bioscience and Biotechnology Research,University of Maryland

Summary

Une méthode d'évolution dirigée roman spécifique au domaine de l'ingénierie thermostabilité a été développé et validé par conséquent, pour les enzymes bactériolytiques. Après un seul tour de mutagenèse aléatoire, une enzyme bactériolytique évolué, PlyC 29C3, affichée deux fois supérieure à l'activité résiduelle par rapport à la protéine de type sauvage après incubation à température élevée.

Abstract

L'évolution dirigée est définie comme une méthode pour exploiter la sélection naturelle, afin de concevoir des protéines d'acquérir des propriétés particulières qui ne sont pas associés à la protéine dans la nature. La littérature a fourni de nombreux exemples concernant la mise en œuvre de l'évolution dirigée pour réussir à modifier la spécificité moléculaire et la catalyse 1. Le principal avantage d'utiliser l'évolution dirigée au lieu de plus rationnel des approches d'ingénierie moléculaire concerne le volume et la diversité des variantes qui peuvent être criblés 2. Une application possible de l'évolution dirigée consiste à améliorer la stabilité structurale des enzymes bactériolytiques, comme endolysins. Bactériophages coder et exprimer endolysins pour hydrolyser une liaison covalente critique dans le peptidoglycane (c.-à-mur cellulaire) des bactéries, ce qui entraîne la lyse des cellules hôte et la libération des virions descendants. Notamment, ces enzymes possèdent la capacité d'induire la lyse extrinsèquement à susceptIble bactéries en l'absence du phage et de plus ont été validées à la fois in vitro et in vivo pour leur potentiel thérapeutique 3-5. L'objet de notre étude de l'évolution dirigée implique la PlyC endolysine, qui est composé de sous-unités PlyCA et PlyCB 6. Lorsque purifiée et a ajouté extrinsèquement, l'holoenzyme PlyC lyse streptocoques du groupe A (SGA) ainsi que d'autres groupes de streptocoques dans une affaire de secondes et a en outre été validés in vivo contre GAZ 7. De manière significative, le suivi cinétique enzymatique résiduelle après incubation à température élevée fournit une preuve distincte qui perd PlyC activité lytique brusquement à 45 ° C, ce qui suggère une courte durée de vie thérapeutique, ce qui peut limiter le développement supplémentaire de cette enzyme. D'autres études révèlent le manque de stabilité thermique est observée uniquement pour la sous-unité PlyCA, tandis que la sous-unité PlyCB est stable jusqu'à ~ 90 ° C (observation non publiée). En plus de PlyC, il existe slusieurs exemples dans la littérature qui décrivent la nature thermolabile de endolysins. Par exemple, le Staphylococcus aureus endolysine LysK et Streptococcus pneumoniae endolysins caporal-1 et Pal perdre activité spontanée à 42 ° C, 43,5 ° C et 50,2 ° C respectivement 8-10. Selon l'équation d'Arrhenius, qui concerne la vitesse d'une réaction chimique à la température présente dans le système particulier, une augmentation de la thermostabilité sera en corrélation avec une augmentation de l'espérance de durée de vie 11. À cette fin, l'évolution dirigée a été montré pour être un outil utile pour altérer l'activité thermique des molécules différentes dans la nature, mais jamais a cette technologie particulière été exploitée avec succès pour l'étude des enzymes bactériolytiques. De même, les comptes de succès de faire progresser la stabilité structurelle de cette classe d'antimicrobiens au total sont inexistants. Dans cette vidéo, nous utilisons une nouvelle méthodologie qui utilise une erreur prune ADN polymérase suivie d'un processus de sélection optimisée à l'aide d'un format de 96 puits de plaque de microtitration pour identifier des mutations de la sous-unité de la PlyCA endolysine PlyC streptocoques qui sont associés à une augmentation de la stabilité cinétique enzymatique (Figure 1). Résultats après un seul tour de mutagenèse aléatoire suggèrent que la méthodologie est la génération variantes PlyC qui conservent plus de deux fois l'activité résiduelle par rapport au type sauvage (WT) PlyC après traitement à température élevée.

Protocol

1. Détermination des conditions optimales de chauffage Tout d'abord, il faut déterminer expérimentalement la température d'incubation optimal et le temps d'utilisation de l'étape de chauffage dans l'essai. Pour notre modèle PlyC, il est important de noter que E. coli co-transformées avec les gènes et plyCA plyCB sur des plasmides d'expression distincts a été montré pour former une holoenzyme entièrement fonctionnel PlyC 6. Les 96 préparation bien microplaque ainsi que les conditions de croissance des cellules et la technique de reproduction ultérieure de placage ont été adaptés à partir des exemples fournis dans la littérature 12-16. Un temps d'incubation de 30 min sera approprié pour cet essai que les résultats des précédentes expériences d'inactivation thermique dicter une perte rapide de l'activité au cours de courte durée d'incubation dans des environnements dépassant la température physiologique (observation non publiée). La température d'incubation optimal pour PlyC a été élucidée par les étapes suivantes: Transform la construction d'expression pBAD24: plyCA (Amp r) dans l'compétente E. coli souche DH5a pBAD33: plyCB (Cm r). Plaque des transformants sur une plaque de gélose Luria-Bertani (LB) additionné d'ampicilline (100 pg / ml) et le chloramphénicol (35 mg / ml). Incuber les plaques pendant la nuit à 37 ° C. Avec un cure-dent stérile, inoculer une colonie individuelle dans chaque rangée de puits (Figure 2a) dans un 96 stérile, limpide, à fond plat et, à couvercle de microplaque contenant 200 pl de LB additionné d'ampicilline et le chloramphénicol. Solidement placer la plaque de microtitration à 96 puits sur un 37 ° C incubateur agitateur et la croissance des bactéries pendant la nuit à 300 rpm. Récupérez la plaque de 96 puits de microtitration à partir de 37 ° C incubateur agitateur et la plaque de réplique à une nouvelle plaque de 96 puits de microtitration comme suit: Ajouter 180 ul de LB additionné d'ampicilline et au chloramphénicoldans chaque puits de la plaque de réplique. Transférer 20 ul de bactéries de la plaque d'origine dans les puits correspondants de la plaque de réplique. Cela devrait se traduire par une DO initiale 600 de ~ 0,5. Solidement placer la plaque sur la réplique 37 ° C incubateur agitateur et incuber la plaque pendant 1 heure à 300 tours par minute, puis ajouter le inductant. Dans le cas des systèmes d'expression pBAD, l'arabinose inductant est de 0,25%. Autres systèmes d'expression peut exiger inductants différentes. Placez la plaque arrière sur le 37 ° C incubateur agitateur et agiter à 300 rpm pour une période supplémentaire de 4 heures pour permettre l'expression des protéines. Les niveaux d'expression varient généralement entre 10-20 g de PlyC. Expression de la protéine une fois terminé, récupérer la plaque de culot réplique et les bactéries en plaçant la plaque de microtitration 96 puits dans une centrifugeuse réfrigérée qui contient un rotor oscillant godet qui correspond à des plaques de microtitration 96 puits. Centrifuger à 3000 rpm pendant 10 min à température ambiante. Eliminer le surnageant par les médias lentement inverser la plaque de microtitration et doucement décantation des médias. Lyser les cellules en ajoutant 50 pl de B-PER II Réactif d'extraction de protéines bactériennes dans chaque puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 20 min. Augmentez le volume dans chaque puits à 120 ul par addition de 70 ul de tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,2. Pellet les débris insolubles cellulaire en faisant tourner la plaque à 3000 rpm pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée. Transfert 110 pi du lysat brut soluble dans les puits correspondants d'une plaque 96 thermocycleur bien. 30 min en utilisant le temps d'incubation prédéterminé, exposer les lysats solubles résidant actuellement dans la plaque 96 puits thermocycleur à une gamme de gradient de température couvrant une large 15-20 ° C. Notez, le but est de déterminer à quelle température une enzyme particulière perd> 95% l'activité catalytique. Après incubation, incuber la 96 puitsthermocycleur plaque à 4 ° C pendant 5 min et 100 pi de transférer les lysats solubles de la plaque 96 thermocycleur bien à leur endroit bien correspondant à la 96 final ainsi microplaque. Avec un multipipettor 12 canaux, ajouter 100 ul de souche D471 GAZ à chaque puits. Remarque, D471 cellules lyophilisées sont à l'origine de cultures de la nuit et remises en suspension dans du PBS pH 7,2 pour obtenir une DO 600 de ~ 2,0. Placez immédiatement la plaque 96 puits dans le spectrophotomètre pour microplaques et contrôler la cinétique enzymatique en mesurant la DO 600 toutes les 15 secondes pendant 20 min. La plus basse température d'incubation qui correspond à un puits qui ne disposent pas de changement de la densité optique (ADO ≤ 0,1) est définie comme la température non permissive. Après un écran large de température est réalisée afin d'identifier la température non permissive, les étapes ci-dessus peut être répété sur une gamme plus étroite de températures (5 ° -10 ° C) pour éluciderla précision de température non permissive pour l'enzyme d'intérêt. Remarque, la température non permissive identifiés dans ce dosage peut être différente de la température de fusion élucidé par d'autres moyens en raison de différences de volume, concentration, etc 2. Génération Mutant la Bibliothèque La création de la banque de mutants à être projeté au hasard consiste à intégrer les mutations d'une ADN polymérase d'erreurs avec un biais minimal de nucléotides dans le gène plyCA utilisant le kit de mutagenèse aléatoire GeneMorph II comme suit: Concevoir des amorces nucléotidiques avec des températures de fusion similaires (T m) entre 55-72 ° C avec les sites de restriction de choix à l'extrémité 5 'et 3' du gène extrémités plyCA. Puisque le taux de mutation souhaitée est de 2-3 nucléotides par plyCA (1,4 kb), utiliser les concentrations des composants de la réaction de PCR ainsi que les conditions thermocycleur recommandés par le fabricant pour f mutation basrequencies (0 à 4,5 par ko). Cloner les gènes mutés plyCA dans le vecteur d'expression pBAD24. Transformer les concepts en un DH5a pBAD33: fond plyCB et les transformants plaque sur des plaques d'agar LB additionné d'ampicilline et le chloramphénicol. En outre, de transformer et de la plaque DH5a pBAD33: plyCB avec le vecteur d'expression contenant le gène pBAD24 WT plyCA. Colonies de cette plaque servira les contrôles en cours de sélection. 3. 96 Préparation Eh bien microplaque et les conditions de la croissance cellulaire Remplir chaque puits d'une plaque de microtitration à 96 puits avec 200 ul de LB additionné d'ampicilline et le chloramphénicol. Après le schéma plaque de microtitration (Figure 2b), sélectionner avec soin une colonie individuelle des plaques de gélose au jour le jour avec un cure-dent stérile et inoculer les bactéries dans la pla désigné puits de la microplaque de 96 puitste. Il est essentiel de veiller à une seule colonie par puits inoculés. Agiter le solidement ancré plaque de 96 puits de microtitration à 300 tpm pendant la nuit à 37 ° C. 4. Placage réplique, induction de l'expression des protéines et préparation de lysat Suivez les étapes 1.5 à 1.11 de la section intitulée «Détermination des conditions optimales de chauffage" avec une modification. Stocker la plaque originale à 4 ° C après l'étape de plaquage réplique a conclu. Après l'étape 1.11, le transfert de 110 pl du lysat brut soluble dans les puits correspondants d'une plaque 96 thermocycleur bien sauf pour le contrôle positif puits A1-D1. En ce qui concerne les lysats témoins positifs (c.-à-lysats qui ne sont pas chauffées), le transfert de 100 ul des lysats dans les puits correspondants dans une nouvelle plaque de 96 puits de microtitration qui servira de plaque de dosage final de l'expérience et de stocker de la glace. 5. Soluble traitement thermique Lysate Chauffer le contrôle négatif et soluble mutant lysats sont actuellement enfermées dans la plaque 96 thermocycleur bien dans le thermocycleur pendant 30 minutes à la température d'incubation non permissif optimisé déterminé à l'étape 1. Après incubation à température non permissive, incuber la plaque à 96 thermocycleur bien à 4 ° C pendant 5 min. Transférer 100 ul des lysats solubles de la plaque 96 thermocycleur et à leurs emplacements de puits identiques lors de la finale plaque de 96 puits d'essai de microtitration contenant déjà les lysats témoins positifs solubles. Avec un multipipettor 12 canaux, ajouter 100 ul de souche D471 GAZ à chaque puits. Placez immédiatement la plaque dans le spectrophotomètre pour microplaques. Surveiller la cinétique enzymatique en mesurant la DO 600 toutes les 15 secondes pendant 20 min. Une variante avec PlyC comportement thermique avancé est défini comme une construction qui peut diminuer la densité optique d'origine de 50 pour cent en moins de 900 secondes à l'température non permissive. En outre, les contrôles positifs (c'est à dire non-chauffée, WT PlyC) doivent afficher WT activité catalytique (t 1/2 ≤ 100 s) et les témoins négatifs (c.-à-chauffé, WT PlyC) devrait être dépourvu d'activité. Une fois avec une variante PlyC progressé comportement thermique est identifié, récupérer la plaque originale conservée à 4 ° C et les bactéries ensemencer de l'individu spécifique et pour le mutant d'intérêt en milieu LB frais additionné d'ampicilline et au chloramphénicol. La croissance de l'inoculum nuit à 37 ° C. Extraire et purifier l'ADN plasmidique de la culture et soumettre ensuite pour le séquençage afin d'identifier les mutations de nucléotides qui signifient comportement thermique amélioré à PlyCA. En outre, en complément d'une petite aliquote de la culture d'une nuit avec 10% de glycérol et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

Representative Results

A l'issue du premier tour de mutagenèse aléatoire, plus de 6000 mutants PlyC ont été examinées et un total de 35 mutants ayant un comportement thermique augmentation potentielle ont été identifiés, sélectionnés et séquencés. L'analyse génomique, résumés dans le tableau I, indiquent que des candidats 35, 7 des constructions contenues WT séquences PlyCA au niveau de la traduction, ce qui correspond à des faux positifs identifiés par l'analyse. Sur les 28 candidats restants, la gamme de mutation était de 1 à 6 mutations nucléotidiques avec un taux moyen de mutation de 2,75 nucléotides par plyCA gène, qui était dans la fourchette de 2-3 mutation nucléotidique nous ciblons. Au niveau de la traduction, cette gamme de mutation nucléotidique particulière et a abouti à la fréquence d'une mutation d'acide aminé gamme de 1 à 5 acides aminés, avec un taux de mutation moyenne de 1,9 mutations d'acides aminés par PlyCA polypeptide. Sur les 28 candidats ayant au moins un acide aminé Mutation, quatre de ces constructions mutantes ont été choisies au hasard pour une caractérisation plus poussée afin de valider que le processus de sélection rigoureux de la méthodologie de l'évolution dirigée a été en effet de fonctionner correctement. Les enzymes mutantes PlyC ont été purifiés à l'homogénéité> 95% sur la base analyse SDS-PAGE comme décrit précédemment 6-7. La cinétique enzymatique d'WT PlyC et chacun des quatre mutants ont été caractérisés à PlyC concentrations molaires égales après incubation des enzymes purifiées à diverses températures élevées. L'activité a été contrôlé après l'ajout de GAZ D471 en mesurant la densité optique à 600 nm toutes les 15 secondes pendant 20 min. L'activité a été définie comme la vitesse maximale résiduelle de l'enzyme après une incubation de chaleur. Parmi les quatre candidats choisis au hasard pour une caractérisation plus poussée, mutant 29C3 a montré le comportement le plus thermique renforcée. Le comportement thermique du WT PlyC et 29C3 a été étudiée à différentes températures pendant l'incubation et le dosage de l'activité dans le PBS pH 7,2 à80 nM et 40 nM, respectivement les concentrations. Les expériences 45-50 ° C d'incubation (figure 3) ont été réalisées dans un thermocycleur où les échantillons ont été incubés dans une paroi mince plaque de 96 thermocycleur puits dans un volume total de 120 pl. Le 35 ° C, 40 ° C et 45 ° C expériences d'incubation (figure 4 et 5) ont été réalisées dans un bloc de chaleur où les échantillons ont été incubés dans un tube de 1,5 ml dans un volume total de 1,3 ml. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. WT PlyC et 29C3 n'a montré aucune différence significative de la stabilité cinétique à la température ambiante (25 ° C) comme décrit dans le premier jeu de barres sur la figure 3. Cependant, après une incubation de courte durée de 30 min à des températures comprises entre 45-50 ° C, l'activité de 29C3 a été sensiblement supérieure à l'activité spécifique de la construction HT au niveau de chaque point de température. Par exemple, WT PlyC affiché une perte de 44% de l'activité à 45,2° C alors que 29C3 a montré qu'une perte de 2% de l'activité à la même température. Les études d'incubation de longue durée comparant l'activité résiduelle de la WT PlyC et 29C3 ont en outre été effectués à 35 ° C et 40 ° C impliquant la mesure de l'activité résiduelle à 24 et 48 points dans le temps h. A 35 ° C, 41% 29C3 affiché et l'activité de 176% plus élevé que WT PlyC à 24 h et de 48 points d'incubation de temps, respectivement (figure 4a). A 40 ° C, 28% 29C3 affiché et l'activité 107% plus élevé que WT PlyC à 24 h et de 48 points d'incubation de temps, respectivement (figure 4b). L'activité résiduelle de WT PlyC et 29C3 ont également été surveillés toutes les 20 minutes pour un total de 3 heures à 45 ° C. WT PlyC n'a pu conserver son activité de 21% après une incubation de 3 h à cette température, tandis que 29C3 est parvenu à maintenir l'activité de 46%. La demi-vie (t 1/2) pour WT PlyC et 29C3 ont été de 67 et 147 min, respectivement, suggèrent ment que 29C3 a une augmentation de 2,2 fois de la stabilité cinétique à 45 ° C (figure 5). Total des candidats Round 1 35 Les candidats ayant WT PlyCA séquence 7 Les candidats ayant ≥ 1 mutation d'acide aminé 28 – Prix moyen Mutation nucléotides (nt / plyCA) 2,75 – Gamme Mutation nucléotides (nt) 1-6 – Taux Amino Acid Mutation (AA / PlyCA) 1,9 – Amino Acid Gamme Mutation (AA) 1-5 Tableau 1. Analyse génomique candidate Pool. pload/4216/4216fig1highres.jpg "/> Figure 1. Réalisé méthodologie d'essai évolution. Dans l'évolution dirigée, on commence avec l'enzyme de plomb, ce qui serait PlyC WT pour le premier tour. Une banque de mutants aléatoires PlyC contenant impartiales mutations de nucléotides du gène plyCA est alors construit par une ADN polymérase d'erreurs, cloné dans le vecteur d'expression pBAD24 et transformé en E. coli souche DH5a contenant déjà pBAD33:. plyCB transformants individuels sont inoculés dans leur propre propre puits d'une plaque de microtitration à 96 puits. Par un processus de recherche exhaustive, chacun des mutants qui sont PlyC catalytiquement actif après incubation à une température non autorisée sont classés comme des mutants ayant une stabilité cinétique accrue. Theconstruct afficher le comportement le plus progressé thermique volonté devient par conséquent l'enzyme de plomb pour le prochain cycle de mutagenèse aléatoire. Globalement, il existe trois séries complètes de random mutagenèse suivie par réarrangement d'ADN résultant en une molécule bactériolytique avec le comportement thermique évolué. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. 96 puits de microplaques pour les modèles d'analyse de l'évolution dirigée. Le schéma microplaque lors de la détermination des conditions de chauffage optimales (Figure 2a) consiste à inoculer un seul des parents WT PlyC clone dans chaque rangée de la plaque de microtitration. La plaque de microtitration schématique en projection mutant (Figure 2b) consiste à inoculer chaque puits de la colonne 1 avec un clone unique, WT parental PlyC ainsi que inoculer chaque puits dans les colonnes 2-12 avec un clone distinct mutant PlyC. Wells A1-D1 sont désignés pour les contrôles positifs des parents, qui coopèrentnsist de WT PlyC constructions non exposés à la température d'incubation non autorisée. Wells E1-H1 sont désignés pour les contrôles négatifs des parents, qui sont constitués de constructions PlyC WT qui sont exposés à la température d'incubation non autorisée. Figure 3. Analyse de l'activité cinétique résiduelle comparant WT PlyC et 29C3. Enzymes ont été purifiées à homogénéité et incubées pendant 30 min dans un thermocycleur pour une même concentration molaire à température ambiante ou à un gradient de température allant de 45-50 ° C. Activité enzymatique corrélée à la vitesse maximale affichée après incubation température donnée. À l'exception de 25 ° C et 47,7 ° C, la variation de l'activité entre WT et 29C3 à chaque température en corrélation avec une valeur de p <0,05. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. </p> Figure 4. Analyse de l'activité cinétique résiduelle comparant WT PlyC de 29C3 à 35 ° C et 40 ° C. égalité des concentrations molaires purifié WT PlyC et 29C3 ont été incubées dans un bloc chauffant à 35 ° C (figure 4a) ou 40 ° C (figure 4b). L'activité enzymatique résiduelle a été mesurée à 24 et 48 points dans le temps h. L'activité affichée par chaque construction a été normalisée par rapport à la vitesse maximale affichée à zéro le temps. La variation de l'activité entre WT et 29C3 à chaque point de température et de temps corrélé à une valeur de p <0,05. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Figure 5. Analyse de l'activité cinétique résiduelle comparantWT PlyC de 29C3 à 45 ° C. égalité des concentrations molaires purifié WT PlyC et 29C3 ont été incubées dans un bloc chauffant à 45 ° C et l'activité enzymatique résiduelle a été mesurée toutes les 20 minutes pendant 3 heures. L'activité affichée par chaque construction a été normalisée par rapport à la vitesse maximale affichée à zéro le temps. À l'exception des points de données à 20 min, la variation de l'activité entre WT et 29C3 à chaque point de temps corrélé à une valeur de p <0,05. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes.

Discussion

Ce protocole, présenté dans la figure 1, présente un 96 méthodologie bien microplaque qui permet d'utiliser l'évolution dirigée d'augmenter la thermostabilité d'une enzyme bactériolytique. Grâce à l'utilisation d'une ADN polymérase d'erreurs, on peut introduire des mutations aléatoires qui augmentent la stabilité globale cinétique de la molécule traduit bactériolytique d'intérêt, ce qui est généralement dû à des réorganisations moléculaires consistant à augmenter électrostatique, hydrophobe pont disulfure et les interactions qui génèrent améliorée empilement moléculaire, des modifications amélioration des réseaux de charge de surface ou le renforcement d'un état ​​supérieur d'oligomérisation 17-18. Après l'introduction de mutations nucléotidiques, une procédure de sélection rigoureux a ensuite été utilisé pour identifier les mutations qui sont thermiquement bénéfique. Les résultats représentatifs présentés ici ont été basées sur un cycle de mutagenèse aléatoire. En réalité, il a été suggéré queau moins trois cycles successifs de mutagenèse aléatoire, chacun utilisant le mutant le plus robuste que l'enzyme tête, suivie par réarrangement d'ADN est approprié pour ces types d'études d'évolution dirigée de comportement thermique 2.

Il est important de comprendre que même si ce protocole identifie des mutations qui augmentent la stabilité cinétique, ces variantes ne sont pas nécessairement thermostabilité accrue. Une molécule est considérée thermostable quand il a la capacité de conserver sa structure, à une température élevée. Toutefois, dans l'essai présenté, l'activité résiduelle des lysats mutants ne sont pas analysés à la même température que ils ont été initialement mis à incuber pendant l'étape de traitement thermique et donc ne peut être la sélection de mutations qui favorisent le repliement plutôt que thermostabilité renforcée 19. Bien que nous soyons d'extrapoler le comportement thermique comme une indication de la stabilité thermique, véritable stabilité thermique doit être mesurée de manière empirique par biophysiquetiques des méthodes telles que le dichroïsme circulaire (CD), la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et fluorimétrie différentielle à balayage (DSF). Les données préliminaires d'expériences de CD et DSF suggèrent que plusieurs candidats identifiés à partir de la méthodologie présentée en effet afficher thermostabilité progressé (données non présentées).

Bien que la méthodologie présentée ici est spécifique à la mise en œuvre augmenté comportement thermique de PlyC, cette même méthodologie peut en outre être utilisé pour améliorer l'activité thermique à d'autres enzymes bactériolytiques avec quelques modifications mineures à des variables telles que des tampons, des taux de mutation, les conditions de chauffage et de systèmes d'expression. Une variable critique associé à ce test concerne le taux de mutation nucléotidique de l'ADN polymérase d'erreurs. Nous avons choisi d'utiliser la polymérase erreurs Mutazyme ADN II dans notre analyse de l'évolution dirigée en raison de preuves expérimentales suggérant cette enzyme affiche le moins de biais avecquant à ce qui nucléotides au hasard incorporé dans le gène d'intérêt par rapport à d'autres techniques de mutagenèse aléatoire, comme l'utilisation de l'hydroxylamine, mutator E. coli et d'autres erreurs ADN polyermases 20. En général, les taux de mutation plus faibles ont tendance à être plus souhaitable pour deux raisons. Tout d'abord, la thermostabilité de l'ingénierie des protéines consiste généralement en relativement peu de substitutions d'acides aminés. Taux de mutation élevés peut provoquer des altérations structurelles dramatiques à des molécules particulières qui peuvent résulter de façon concluante dans le mauvais repliement structurelle et anomalie de fonctionnement. Par exemple, l'incorporation de la glycine et de résidus proline peuvent perturber alpha structures hélicoïdales secondaires 21. Deuxièmement, les taux élevés de mutations de nucléotides augmenter les chances d'intégrer des codons stop prématurés, ce qui entraîne des molécules tronquées qui sont biologiquement inactifs. En général, les taux de mutation plus faibles sont préférés car d'erreur plus faible taux de résultat dans le accumultion des mutations adaptatives alors que les taux de mutation plus élevés générer des mutations neutres ou nuisibles 22.

Pour chaque tour de mutagenèse aléatoire, une autre variable essentielle que l'on doit optimiser implique la température d'incubation utilisé pendant le processus de sélection. Sélection de l'expérimental température non permissive est relativement difficile. Nous avons d'abord utilisé une température d'incubation qui était de 10 ° C supérieure à la température non permissive de PlyC, mais après criblage de mutants 3000, nous avons été incapables d'identifier les mutations avantageuses. Gardant à l'esprit les méthodes d'évolution dirigée consistent à identifier séquentiellement bénéfiques substitutions d'acides aminés qui ont des effets additifs, il a été déterminé que la température moins rigoureuse doit être utilisé pendant le processus de sélection, même si elle a augmenté le risque de générer des faux positifs. En tant que tel, nous avons utilisé une température d'incubation qui n'était que de quelques degrés au-dessus du non-admtempérature ive et retamisé candidats sélectionnés pour exclure les faux positifs.

Nous avons décidé d'utiliser une température d'incubation qui n'était pas trop tempéré (≤ 1 ° C plus élevée à la plus basse température non permissive) et, inversement, pas trop sévère (≥ 5 ° C plus élevée à la plus basse température non permissive). La température idéale, nous avons décidé d'utiliser dans cet essai particulier était de 2 ° C de plus modéré que le déterminées expérimentalement température non permissive. Le choix d'une température trop douce se traduira par un taux beaucoup plus élevé de faux positifs d'identification de l'~ 20%, nous avons observé (tableau I) lorsque vous utilisez une température d'incubation modérée. De plus, en utilisant une température d'incubation qui est trop sévère pourrait finalement aboutir à l'impossibilité d'identifier des mutants avec le comportement thermique nettement améliorée. Par exemple, en utilisant une température d'incubation de ≥ 5 ° C aurait entraîné l'impossibilité d'identifier l'promettant mutant 29C3 ainsi que la majorité des autres candidats sélectionnés lors du premier tour de dépistage.

En résumé, nous proposons un protocole d'enzymes d'ingénierie bactériolytiques d'acquérir une meilleure stabilité cinétique. En outre, ce même test, sans que les étapes de chauffage, peuvent être utilisés pour cribler des mutations qui augmentent l'activité catalytique. Augmentant à la fois l'activité catalytique et une thermostabilité est un obstacle important au développement face à une enzyme thérapeutique. Bien que les détails de ce protocole sont spécifiques à la PlyC endolysine, la méthodologie peut être adaptée à n'importe quelle enzyme bactériolytique avec seulement quelques modifications. Nous avons présenté les résultats préliminaires à partir de seulement le premier tour de mutagenèse qui valide le fait que la fonctionnalité de l'essai, ce qui entraîne la mise en œuvre et l'identification de mutations qui génèrent une augmentation de la thermostabilité moléculaire de grande ampleur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Emilija Renke et Janet Yu pour l'assistance technique. DCN est soutenu par des subventions du ministère américain de la Défense (DR080205, DM102823, OR09055 et OR090059). RDH est soutenu par une subvention de la station de Maryland Expérience agriculture et une subvention de formation NIH en biologie cellulaire et moléculaire.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 78260
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit Agilent Technologies 200500
Clear 96 Well, Flat-bottomed Microtiter Plate With Lid BD Vacutainer Labware Medical 353072
96 Well Nonskirted PCR Plates Fisher Scientific 14-230-232
Swing-bucket Rotor Eppendorf A-2-DWP
Ampicillin Sodium Salt Fisher Scientific BP1760
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904
Arabinose Fisher Scientific BP2504
pBAD24 Expression Vector ATCC 87399
pBAD33 Expression Vector ATCC 87402
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References

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Heselpoth, R. D., Nelson, D. C. A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes. J. Vis. Exp. (69), e4216, doi:10.3791/4216 (2012).
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