Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em> In-situ</em> Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em> LacZ</em>-Tagged Tumor Cells

1. In-situ Lung Perfusion und Fixation Anästhesieren Mäusen durch ip Injektion von ~ 150 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 112,5 mg / kg (Körpergewicht) Ketamin, 16,5 mg / kg Xylazin und 15 mg / kg Acepromazin (oder durch eine andere geeignete Anästhesie enthält Schmerzmittel). Wenn Reflexe der Maus nicht mehr beobachtet werden, fixieren sie auf dem OP-Tisch zurück-down-und benetzen das Fell mit 70% Ethanol zu slick den Haaren nach unten. Öffnen Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals und ziehen Sie sie an den Seiten oder entfernen. Öffnen Sie das Bauchfell und den Brustkorb auf eine reichliche Größe. Verhindern von großen Brüchen Gefäße (zB die Vena jugularis) in reduzierter Effizienz der nachfolgende Perfusion vermeiden. Schneiden Sie die Vena cava caudalis unter der Leber. Verwenden eines 20-ml-Spritze mit einer 21G ausgestattet – 24G Nadel langsam 10-15 ml PBS in den rechten Ventrikel des schlagenden Herzens zu injizieren, bis die Lungen vollständig weiß unddas Herz aufhört zu schlagen (Asystolie). Abkneifen die Blutgefäße der Leber und der Membran mit einer Gefäßklemme. Eine 10 ml Spritze mit einer 21G ausgestattet – 24G Nadel auf ~ 2 ml 3% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in den rechten Ventrikel zu injizieren. Entdecken Sie die Luftröhre außerhalb des Thorax. Verwenden das gleiche Spritze auf ~ 3 ml 3% PFA in PBS kraniale (außerhalb des Thorax) injizieren in die Trachea bis zur Lunge aufgeblasen wird. Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel, abkneifen die Luftröhre kaudalen der Punktion mit einer Gefäßklemme und für 10 min, um die Fixierung zu ermöglichen. Durchschneiden die Blutgefäße oberhalb der Gefäßklemme, entfernen die Klemme und injizieren ~ 2 ml PBS in die rechte Herzkammer, um überschüssiges PFA entfernen. Punktieren der unteren Teile aller Lungenlappen mit einer Nadel, entfernen die Gefäßklemme an der Trachea und injizieren 3-5 ml einer Lösung von PolyFreeze Einbettungsmedium / PBS 1:1 in der Luftröhre kaudalen des ersten Punktion bis PFA in der LungeLappen durch die Lösung ersetzt. Entfernen Sie die Lunge sorgfältig, indem das Herz mit einer Pinzette und durch Durchschneiden des Bindegewebes Bändern, Blutgefäßen und der Luftröhre. Halten Sie das Herz an der Lunge. Je nachdem, wie mit dem Lungengewebe Analyse gehen mit den Protokollen in den Abschnitten 2 und 3 beschrieben fortsetzen. Wenn Sie beide Analysen durchführen möchten, entfernen Sie ein Lungenlappen und wie unter 3 beschrieben. Verarbeiten Sie die verbleibenden Lappen mit dem Herzen wie unter Punkt 2 beschrieben. 2. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Entire Lungenlappen Legen Sie die Lunge in einen Plastikbecher mit engen schließenden Deckel aufsetzen und mit 2% Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30-60 min. Entfernen Fixierungslösung und gründlich 3-mal mit PBS. Hinzufügen mindestens 10 ml frisch hergestellte 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) Färbelösung (X-Gal Stammlösung [40 mg / ml inDimethylformamid] 1:40 verdünnt in Basic Färbelösung; pH 7,1 (Tabelle 1); vor Licht schützen). Legen Sie ein Stück Gaze auf der Oberseite des Swimming Lungen, um es vollständig zu halten in der Lösung und setzen Sie den Deckel nur lose auf dem Topf, den Austausch von Luft zu ermöglichen. Inkubation bei 37 ° C für 3-5 Stunden vor Licht geschützt. Entfernen X-Gal-Lösung, einmal mit PBS spülen, um restliches X-Gal-Lösung (optional) entfernen und 4% PFA. 3. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Lung Kryoschnitte Vorfüll ein markiertes Einbettform bis 1/3 mit unverdünntem PolyFreeze Einbettungsmedium. Legen Sie die Lungenlappen oben und füllen sich mit Einbettmedium bis der Lappen vollständig bedeckt ist. Versuchen Sie, um Blasen zu verhindern. Inkubieren der eingebetteten Lungen bei 4 ° C für 20 min. Dann frieren die eingebettete Lunge langsam in einer Mischung aus Trockeneis und Isopentan und bei -80 ° C. Cut 7-10 um KryoAbschnitte auf einem Kryostaten und montieren sie auf SuperFrostPlus Objektträger. Inkubiere die Abschnitte sofort mit X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer. Spülen Sie die Objektträger in PBS 2 mal für 5 min und dann kurz in destilliertem Wasser. Counter-Fleck mit Kernechtrot für 10-30 sec gründlich in destilliertem Wasser und montieren Sie die Folien mit Immu-Mount. 4. Repräsentative Ergebnisse Asai et al. Im ursprünglichen Artikel auf der Dunn-OS abgeleiteten LM8 Mausmodell dass sc Primärtumoren von den parentalen Dunn Zellen abgeleitet, die sich von denen aus der hoch metastatischen LM8 Sub-Zelllinie abgeleitet sind, nicht spontan bilden nachweisbare Lungenmetastasen in gemeldet syngenen C3H Mäusen 14. Mit den hier berichteten Techniken, untersuchten wir die Bildung von Metastasen in den Dunn/LM8 Maus OS-Modelle. Wir nutzten stabile lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zelles und eines Protokolls für in-situ Lungenperfusion und Fixierung in Mäusen. Repräsentative Bilder perfundierten und nicht-perfundierten Lungen von Mäusen subkutan injiziert mit lacZ-transduzierten und nicht-transduzierten Steuerung Dunn und LM8 Zellen in Abbildung 1 gezeigt. In Mäusen, die mit Zellen injiziert Steuerung Dunn blieb makroskopischen und mikroskopischen Metastasen in nicht nachweisbar nicht perfundierten und perfundierten Lunge (1A, i-iv). Aber interessanterweise in Mäusen mit Dunn-lacZ-Zellen injiziert, offenbarte X-gal-Färbung blauen mikrometastatischen Foci von Einzelzellen oder kleinen Zellaggregaten (<0,1 mm) auf der Oberfläche des nicht-perfundierten Lunge (Abbildung 1A, vi). Im situ Perfusion und Fixierung der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Dunn-lacZ Mikrometastasen (1A, viii). Jedoch wurde Auswuchs auf makroskopische Foci nicht beobachtet (Abbildung 1A, V, VII). </ P> Bei Mäusen mit Steuerung LM8 Zellen, transluzent, kaum nachweisbar macrometastatic Foci injiziert größer als 0,1 mm Durchmesser wurden im nicht-perfundierten Lunge (1B, i) erfasst. Perfusion der Lunge (1B, iii) nicht verbessert die Erkennung der Brennpunkte. Jedoch in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen injiziert mehrere X-Gal blau gefärbt makro-(1B, v) und Mikrometastasen (1B, vi) wurden auf der Oberfläche von nicht-perfundierten Organen detektiert. Darüber hinaus Perfusion der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Makro-und Mikrometastasen (Abbildung 1B, VII – VIII). Folglich wurde der Mikro-und sichtbaren Makrometastasen bei einer höheren Dichte und einer größeren Anzahl, hauptsächlich aufgrund der Durchsichtigkeit des perfundierten Gewebe, in dem Brennpunkte unterhalb der Organoberfläche wurde ebenfalls sichtbar. Ein zusätzlicher histological Analyse mit Gefrierschnitten des Lungengewebes bestätigt die verbesserte Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bei Mäusen mit lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zellen injiziert. Bei Mäusen mit Primärtumoren von Dunn-lacZ oder lacZ LM8-Zellen abgeleitet wurden im Gegensatz zu Mäusen, die mit primären Tumoren der jeweiligen Kontrollzellen, Mikrometastasen oder sogar einzelne Zellfoci in Lungenschnitten (Abbildung 2) erfasst. Darüber hinaus waren auch Makrometastasen deutlicher sichtbar in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen als bei Tieren mit der Steuerung LM8 Zellen (2C, D) injiziert. Abbildung 1. Nachweis von spontanen Metastasen von nicht-transduzierten (i-iv) und lacZ-transduzierten (v-viii) Dunn (A) und LM8 (B) Zellen im nicht-perfundierten (i, ii, v, vi) und perfundierten (iii, iv, vii, viii) Lungen in C3H-Mäusen. Metastasen in repräsentativen X-Gal-stained ganzen Lunge (v, vii in A und B) und die entsprechenden Nahaufnahmen (vi, viii in A und B) blau erscheinen. Macrometastatic Brennpunkte (> 0,1 mm) in den Organen von Mäusen mit nicht-markierten Zellen LM8 (i-iv in B) eingespritzt sind durch Sternchen gekennzeichnet. Bereiche, in Nahaufnahmen sind repräsentativ für die gesamte Lunge. Maßstab Balken zeigen 1 mm in Bildern ganzer Lunge und 0,1 mm in Nahaufnahmen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . Abbildung 2. Erkennung von Dunn und LM8 Mikrometastasen in der Lunge Kryoschnitten. Abschnitte von OCT eingebettet Lungengewebe wurden in X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer inkubiert und dann gegengefärbt mit Kernechtrot. Pfeile zeigen auf mikrometastatischen Foci in Lungenschnitten von Mäusen mit Dunn-lacZ (B) oder LM8-lacZ-Zellen (D) eingespritzt erfasst. Micrometastases blieb nicht nachweisbar in Lungenschnitten von Mäusen mit nicht-transduzierten Dunn (A) oder LM8 Zellen (C) injiziert. Maßstab Balken zeigen 0,1 mm.