Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné<em> In situ</emPerfusion> du tissu pulmonaire et coloration X-gal de<em> LacZ</em>-Tag cellules tumorales

1. Perfusion pulmonaire in situ et de fixation Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de ~ 150 ul solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 112,5 mg / kg (poids corporel) kétamine, 16,5 mg / kg de xylazine et 15 mg / kg acépromazine (ou par un autre anesthésie contenant des analgésiques appropriés). Lorsque les réflexes de la souris ne sont plus respectées, le fixer sur la table d'opération en arrière vers le bas et mouiller le pelage avec de l'éthanol à 70% lisses les cheveux vers le bas. Ouvrir la peau de l'abdomen jusqu'au cou et tirez-le vers les côtés ou le supprimer. Ouvrez le péritoine et le thorax à une taille suffisante. Prévenir les ruptures de vaisseaux de grande taille (par exemple, la veine jugulaire) afin d'éviter une perte d'efficacité de la perfusion ultérieure. Couper la veine cave caudale sous le foie. Utilisez une seringue de 20 ml équipé d'un 21G – 24G aiguille pour injecter le produit lentement 10-15 ml de PBS dans le ventricule droit du cœur battant jusqu'à ce que le poumon est complètement blanc etle cœur cesse de battre (asystolie). Pincer les vaisseaux sanguins au-dessus du foie et le diaphragme avec une pince vasculaire. Utiliser une seringue de 10 ml équipé d'un 21G – 24G aiguille pour injecter ~ 2 ml de paraformaldéhyde à 3% (PFA) dans le PBS dans le ventricule droit. Découvrir la trachée à l'extérieur de la cage thoracique. Utilisez la même seringue pour injecter ~ 3 ml de PFA 3% dans du PBS crânienne (à l'extérieur du thorax) dans la trachée jusqu'à ce que le poumon est gonflé. Immédiatement après le retrait de l'aiguille, pincer la trachée caudale de la perforation avec une pince vasculaire et d'attendre 10 minutes pour permettre la fixation. Transect les vaisseaux sanguins au-dessus du clamp vasculaire, enlever le collier et injecter ~ 2 ml de PBS dans le ventricule droit pour enlever l'excès PFA. Percer les parties inférieures de l'ensemble des lobes de poumon avec une aiguille, retirer la pince vasculaire à la trachée et injecter 3-5 ml d'une solution d'enrobage moyen PolyFreeze / PBS 1:1 dans la trachée caudale de la première perforation jusqu'à ce que le PFA dans l' poumonlobes est remplacé par la solution. Retirez soigneusement le poumon en tirant sur le cœur avec une pince et en sectionnant les ligaments du tissu conjonctif, des vaisseaux sanguins et la trachée. Gardez le coeur relié aux poumons. Selon la façon de procéder à l'analyse des tissus du poumon continuent avec les protocoles décrits dans les sections 2 ou 3. Si vous voulez faire les deux analyses, enlever un lobe du poumon et procédez comme décrit au point 3. Traiter les lobes restants liés au cœur, comme décrit au point 2. 2. Visualisation de lacZ-taggés cellules tumorales métastatiques dans les lobes pulmonaires entières Placer le poumon dans un gobelet en plastique avec couvercle à fermeture étanche et le fixer avec du formaldéhyde à 2% dans du PBS à température ambiante pendant 30-60 min. Retirer la solution de fixation et de bien se laver 3 fois avec du PBS. Ajouter au moins 10 ml fraîchement préparée 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) solution de coloration (solution mère de X-Gal [40 mg / ml dansDiméthylformamide] 1:40 diluée dans une solution de coloration de base, pH 7,1 (tableau 1); abri de la lumière). Placer un morceau de gaze sur le dessus du poumon natation de le garder complètement dans la solution et placez le couvercle que faiblement sur le pot pour permettre un échange d'air. Incuber à 37 ° C pendant 3-5 h abri de la lumière. Retirer X-Gal solution, rincer une fois avec du PBS pour éliminer les résidus X-Gal solution (en option) et ajouter 4% de PFA. 3. Visualisation de lacZ-taggés cellules tumorales métastatiques pulmonaires dans cryosections Prefill un moule d'enrobage étiqueté à 1/3 avec support intégration PolyFreeze non dilué. Mettre le lobe pulmonaire sur le dessus et remplir avec incorporation moyen jusqu'à ce que le lobe est entièrement recouvert. Essayez d'éviter les bulles. Incuber les poumons incorporés à 4 ° C pendant 20 min. Puis geler les poumons embarqués lentement dans un mélange de glace sèche et l'isopentane et conserver à -80 ° C. Couper um 10.07 cryosections sur un cryostat et les monter sur des lames de microscope SuperFrostPlus. Incuber les sections immédiatement avec une solution de coloration X-Gal à 37 ° C pendant 24 heures dans une chambre humide. Rincer les lames dans du PBS 2 fois pendant 5 min, puis brièvement dans de l'eau distillée. Contre-coloration avec le rouge rapide nucléaire pendant 10-30 secondes, rincer à l'eau distillée et monter les lames avec Immu-Mount. 4. Les résultats représentatifs Asai et al. Rapporté dans l'article d'origine sur le modèle de Dunn dérivé LM8 souris OS que les tumeurs sc primaires dérivées des cellules parentales Dunn, différents de ceux issus de la grande lignée de cellules métastatique LM8 sous, ne forment spontanément des métastases pulmonaires détectables dans syngéniques C3H 14. Avec les techniques rapportées ici, nous avons une nouvelle enquête de la formation de métastases dans les modèles Dunn/LM8 OS souris. Nous avons profité de lacZ stable transduites par Dunn et LM8 cellules et d'un protocole pour la perfusion du poumon in situ et de la fixation sur des souris. Des images représentatives des poumons perfusés et non perfusée de souris injectées avec lacZ sous-cutanée transduites et non transduites contrôle Dunn et LM8 cellules sont représentées sur la figure 1. Chez les souris injectées avec des cellules de contrôle Dunn, métastases macroscopiques et microscopiques restée indétectable dans les poumons perfusés et non perfusés (figure 1A, i-iv). Mais, curieusement, chez des souris injectées avec des cellules Dunn-lacZ, coloration X-gal a révélé bleu micrométastatique foyers de cellules simples ou amas de cellules de petite taille (<0,1 mm) sur la surface de la non-perfusés poumons (figure 1A, vi). In- perfusion in situ et la fixation des poumons encore amélioré la détectabilité de Dunn-lacZ micrométastases (figure 1A, viii). Cependant, excroissance au macroscopique des foyers n'a pas été observé (figure 1A, v, vii). </ P> Chez les souris injectées avec des cellules de contrôle LM8, translucides, à peine détectable macrométastatique foyers supérieure à 0,1 mm de diamètre ont été reconnus dans les poumons non perfusés (figure 1B, i). Perfusion du poumon (figure 1B, iii) n'améliore pas la détection des foyers. Cependant, chez les souris injectées avec LM8-lacZ plusieurs cellules X-Gal teinté bleu macro-(figure 1B, v) et micrométastases (figure 1B, vi) ont été détectés à la surface de la non-perfusés organes. En outre, la perfusion des poumons en outre amélioré la détectabilité des macro-et micro-métastases (figure 1B, vii – viii). Par conséquent, les micro-et macrométastases est devenu visible à une densité plus élevée et un plus grand nombre, principalement en raison de la translucidité du tissu perfusé dans lequel foyers sous la surface de l'organe est devenu aussi visible. Une h supplémentaireanalyse istological utilisant cryosections de tissu pulmonaire confirmé l'amélioration de la détectabilité des métastases pulmonaires chez des souris injectées avec lacZ transduites par Dunn et LM8 cellules. Chez les souris ayant des tumeurs primaires dérivées de Dunn-lacZ ou LM8-lacZ cellules, contrairement aux souris atteintes de tumeurs primaires des cellules témoins respectifs, des micrométastases ou de cellules, même seul foyers ont été constatés dans les sections du poumon (figure 2). En outre, macrométastases étaient également plus clairement visible dans les souris injectées avec des cellules LM8-lacZ que chez les animaux injectés avec le contrôle LM8 cellules (figure 2C, D). Figure 1. Détection de métastases spontanées de non transduites (i-iv) et lacZ-transduction (v-viii) Dunn (A) et LM8 (B) dans les cellules non perfusé (i, ii, v, vi) et perfusé (iii, iv, vii, viii) les poumons chez les souris C3H. Métastases représentant X-Gal-staINED poumons entiers (v, vii en A et B) et correspondant en gros plan (vi, viii A et B) apparaissent en bleu. Macrométastatique foyers (> 0,1 mm) dans les organes de souris injectées avec des cellules marqués LM8 (i-iv en B) sont indiqués par des astérisques. Zones indiquées dans les gros plans sont représentatifs de poumons entiers. Barres d'échelle indiquent 1 mm dans les images de poumons entiers et 0,1 mm en gros plan. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. Détection de Dunn et LM8 micrométastases dans cryosections pulmonaires. Des coupes de tissu pulmonaire octobre embarqué ont été incubés dans X-Gal solution de coloration à 37 ° C pendant 24 heures dans une chambre humide et ensuite contre le nucléaire rapide rouge. Les flèches indiquent micrométastatique foyers reconnus dans les sections de poumons de souris injectées avec Dunn-lacZ (B) ou LM8-lacZ cellules (D). Micrometastases restée indétectable dans les sections de poumon de souris injectées avec des non-transduites Dunn (A) ou LM8 cellules (C). Barres d'échelle indiquent 0,1 mm.