Transfection נוגדן לנוירונים ככלי ללימוד פתוגנזה מחלות
Summary
גישה מהירה כדי לחקור אינטראקציות והשפעות על מנגנונים מולקולריים הקשורים לנוכחות של נוגדנים בסביבה תאית מתוארת. השיטה כרוכה transfection של נוגדנים לתאים חיים באמצעות היווצרות מורכבת שאינן קוולנטיים המבוססת על ניסוח שומנים בדם. הטכניקה ניתנת להתאמה לשורות תאים הנציחו ותאים ראשוניים.
Abstract
נוגדנים לספק את היכולת לקבל תובנה רומן לאירועים שונים המתרחשים במערכות חיים. היכולת לייצר נוגדנים ספציפיים מאוד לחלבוני היעד אפשרה לשאלות ביולוגיות מדויקות מאוד להתייחסות. חשוב לציין, הנוגדנים היו מעורבים בפתוגנזה של מספר המחלות אנושיות לרבות זאבת מערכתית (לופוס), דלקת מפרקים שגרוניים (RA), תסמונות paraneoplastic, טרשת נפוצה (MS) וטיפוס אנושי T-lymphotropic וירוס 1 (HTLV-1) קשור myelopathy / paraparesis ספסטית הטרופית (HAM / כפית) 1-9. איך לגרום למחלה היא נוגדני שטח של חקירה מתמשכת, והנתונים מצביעים על כך שאינטראקציות בין מולקולות נוגדנים ותוצאות תאיות שונות בדלקת, שינו סלולריים הודעות, ואפופטוזיס 10. הוכח כי חולים עם טרשת נפוצה וHAM / TSP לייצר נוגדנים עצמיים לחלבונים התאיים RNA מחייבים חלבונים הטרוגנית ribonuclear1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. הנתונים האחרונים מצביעים על כך נוגדנים לאנטיגנים משטח תוך עצבי ושניהם פתוגניים 3, 5-9, 11. לפיכך, הליך המאפשר לחקר נוגדנים תאיים: אינטראקציות חלבון הייתי משאיל תובנה גדולה להיווצרות מחלה.
גני transfected נפוץ לתוך תאים ראשוניים וקווים סלולריים בתרבות, לעומת זאת transfection של נוגדנים לתאים התעכב בשל שינוי של מבנה נוגדנים או יעילות transfection עניה 12. שיטות אחרות של transfection כוללות transfection נוגדן המבוסס על יפוזומים קטיוני (מורכב DOTAP / סמים) וpolyethylenimines (PEI); שניהם גרמו לירידה של פי עשרה בtransfection נוגדן השוואה לקבוצת ביקורת 12. השיטה מבוצעת במחקר שלנו היא דומה לשיטות קטיוני שומנים בתיווך ומשתמשת במנגנון מבוסס שומנים ליצירת קומפלקסים שאינם קוולנטיים עם הנוגדנים דרך אלקטרוסטטי וhydrאינטראקציות ophobic 13. אנו מנוצלים מגיבים Ab-סחורה ב, שהוא ניסוח שומנים מסוגל ללכוד נוגדנים דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופובי שאינם קוולנטיים ואספקתם בתוך תאים. לפיכך כימי וגנטיים זיווגים אינם הכרחיים עבור משלוח של נוגדנים פונקציונליים לתוך תאי חיים. שיטה זו אפשרה לנו לבצע מעקב נוגדנים שונים וניסויי חלבון לוקליזציה, כמו גם את הניתוח של ההשלכות המולקולריות של נוגדנים תאיים: אינטראקציות חלבון 9.
בפרוטוקול זה, אנו נראים כיצד transfect נוגדנים לנוירונים במהירות, reproducibly ועם רמה גבוהה של יעילות transfection. כדוגמה, ישתמשו נוגדני A1 ואנטי IgG נגד hnRNP. לכימות קל של יעילות transfection השתמשנו נוגדני A1 אנטי hnRNP כותרתו עם ATTO-550-NHS וFITC שכותרת IgG. Atto550 NHS הוא תווית חדשה עם ספיגה מולקולרית גבוהה והקוונטים ייישן. מקור עירור ומסנני ניאון לAtto550 דומה לCy3 (שמות 556 Em. 578). בנוסף, יש Atto550 photostability גבוה. FITC מתויג-IgG שמש כבקרה כדי להראות ששיטה זו היא תכליתית ולא לצבוע תלוי. גישה זו והנתונים שיופקו תסייענה בהבנה של התפקיד שנוגדנים לאנטיגנים תאיים היעד עשויים לשחק בפתוגנזה של מחלות בבני אדם.
Protocol
Discussion
על מנת לבדוק את ההשערות לגבי מולקולות ספציפיות וביטוייהם, גנים ווקטורים אחרים transfected נפוץ לתוך תאים. ההיבט הייחודי של הליך זה הוא היכולת בקלות transfect נוגדנים לתאי המטרה. בצענו בשיטה זו בחמישה ניסויים נפרדים, כל אחד בכפילויות. תוצאות יעילות transfection היו דומות בכל הניסויי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי משרד המחקר והפיתוח, מחקר רפואי שירות, מחלקה לענייני יוצאי הצבא. מחקר זה מומן בפרס הצטיינות VA סקירה (לMCL) ואוניברסיטת טנסי קרן למדעי בריאות במרכז לחקר טרשת נפוצה על ידי.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | |
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | |
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 |
| PBS | Ambion | 9626 |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | |
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful ‘passive transfer’ of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
