Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

A. Materiales necesarios: Véase la Tabla 1 (reactivos) antes de la preparación HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10X + 900 ml de H 2 0 + 1% de penicilina / estreptomicina (almacenado en el refrigerador o se mantuvieron en hielo). 20% stock de BSA se hace en agua y se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C. HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml de 20% de BSA (concentraciones finales de 0,3% de BSA es) Islet medio: RPMI + 10% de FBS + glutamina 1% + 1% penicilina / estreptomicina Histopaque 1100: 240 ml Histopaque 1119 + 200 ml 1077 Histopaque Sutura 4-0 (McKesson): cortado en 2 ¾ pulgadas piezas y almacenado en una caja de Petri 10 cm Instrumentos: Doble las pinzas de herramientas de la ciencia Artes a 90 °, y limar los dientes de sierra de los tres pares de pinzas. El objetivo es opaco a los dientes, no para eliminarlos. Cánula para la administración de la mezcla de colagenasa / proteasa: 27G ½ pulg aguja, 30 ½ pulgadasaguja, PE50 tubo cortado en piezas de 12 pulgadas. Presentar dos agujas a un final suave y redondeada que no tiene bordes afilados. Insertar la aguja 27G en un extremo de una pieza de 12 pulgadas de tubo de PE50. Retire la aguja 30G de la caja por la rotura de la carcasa con un par de alicates, girando la carcasa de ¼ de vuelta cada vez. Retire la aguja con las pinzas de la carcasa y la inserta en el otro extremo de la tubería PE50 bajo un microscopio de disección. Asegúrese de no doblar la tubería como se inserta la aguja en el tubo PE50. La aguja 27G es el extremo que va a conectar la jeringa de la colagenasa. La colagenasa (CI zyme MA) y Neutral Protease (CI zyme BP). Reconstituir la TDE según instrucciones del fabricante. Consulte el Certificado lote específico de análisis para calcular la concentración de la actividad enzimática. Transferencia de un total de 350.000 colágeno degradantes actividad (CDA) unidades de la colagenasa reconstituido y 100.000 unidades de proteasa neutral de la reconstitbuido Proteasa BP en un tubo cónico y se completa hasta 15 ml en total en HBSS (P / S) B. Paso a Paso Protocolo 1. La inflación del páncreas con la mezcla colagenasa / Proteasa Eutanasiar ratón por dislocación cervical, saturar el torso ratón con 70% de EtOH, la cavidad abdominal abierta completamente del ano a diafragma con las tijeras de disección y pinzas. Coloque el mouse sobre la plataforma de un microscopio de disección. Tire el ciego y el colon ascendente hacia fuera y puso fuera de la cavidad del cuerpo hacia la izquierda. Véase la Figura 1 para un resumen de los pasos siguientes. Coloque los lóbulos del hígado contra el diafragma, sino que debe permanecer allí si la cavidad corporal es lo suficientemente abierto. Encontrar la arteria hepática, vena portal y el haz del conducto biliar que conduce al hígado agarrando el duodeno con pinzas curvas. Con otro par de pinzas curvas, llegar debajo de la arteria, vena, y bu conductondle y saque un 2 ¾ pulgadas pedazo de sutura 4-0 en la arteria, vena conducto biliar, y lo atan una vez y tire con fuerza tan cerca del hígado como sea posible. Utilizando dos pares de pinzas curvas, cuidadosamente agarrar el duodeno y encontrar el conducto biliar unido al duodeno en la papila. Utilice una tenaza de la pinza para perforar el páncreas y el derecho del tejido conectivo debajo de la estrecha vía biliar a la papila. Mete la pinza rápidamente a través del órgano para hacer un agujero y luego puso las dos pinzas de fórceps medio y coge otro trozo de 2 ¾ pulgadas de sutura 4-0 y atarlo a través de una vez y tire de ella a un pequeño círculo, pero NO tire fuertemente. Cambiar a los 90 ° fórceps y las tijeras Vannas superfinas. Con las pinzas de 90 °, con cuidado apretar y tirar del intestino delgado hasta el conducto biliar es tensa. Hacer un corte horizontal a través de la papila con las tijeras por apuñalamiento las tijeras abiertas en el intestino y después cortando con un solo movimiento. Trate de hacer solo one cortar a través de la papila sin desplazar el conducto de la bilis desde la papila. Mientras mantiene el intestino con los fórceps 90 °, inserte la cánula en el conducto biliar hasta la mitad de la longitud de la vía biliar, a continuación, tire suavemente de la sutura apretada alrededor de la cánula. Llene una jeringa de 3 ml con 2,0 ml de la mezcla de colagenasa / proteasa y se inyecta dentro de la cánula a un ritmo lento y constante. Después de inflación del páncreas, retire la cánula de la vía biliar y el uso de las pinzas curvas y tijeras curvas de primavera para extirpar el páncreas hinchado comenzando en el colon descendente y cortando el tejido conectivo como usted tira los intestinos hacia arriba. Continuar para extirpar el páncreas de los intestinos hasta llegar a la vía biliar, a continuación, retire el páncreas del bazo, el estómago y de las vísceras de la cavidad abdominal. Termine de retirar al cortar lejos las suturas. Añadir el páncreas a un tubo de 50 ml que contiene 5 ml de HBSS(P / S). Este tubo debe ser en hielo. Repetir el procedimiento anterior para cada animal de hasta cuatro animales. Para obtener resultados óptimos, se disocian sólo cuatro pancreata de una sola vez. Por lo general, mientras que los cuatro primeros están en el baño a 37 ° C, inflamos otro pancreata cuatro. 2. Páncreas La disociación Colocar los tubos de 50 ml que contienen la pancreata en un baño a 37 ° C durante 15 min. Agite suavemente el tubo y compruebe que la disociación del tejido, asegúrese de tejido se deshace fácilmente, entonces remolino de los tubos 12 veces mientras que usted está sosteniendo el tubo con la tapa. Añadir no más de 30 ml de HBSS (BSA) (esta puede ser una cantidad menor, dependiendo de cuánto se requiere para equilibrar los tubos para el paso de centrifugación), y se centrifuga a 290 xg durante un minuto. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente y dejar una pequeña cantidad de sobrenadante (2-3 ml) en la parte inferior a fin de no perturbar el sedimento celular. Uso de una jeringa de 30 ml attached a 14G aguja, añadir no más de 10 ml de HBSS (BSA) y se aspira la suspensión arriba y hacia abajo 2 veces. Filtrar la mezcla de células a través de un colador de té de plástico en un tubo de 50 ml y enjuague con otro HBSS 10 ml (BSA). Centrifugar a 330 xg durante 2 min. Decantar el sobrenadante e invertir los tubos para drenar en una toalla de papel absorbente durante 1 min. Resuspender cada tubo 10 ml en frío 1100 histopaque. Superponer el histopaque con 10 ml de HBSS (BSA) y se centrifuga a 900 xg durante 18 min. Retire el completo de 20 ml de sobrenadante utilizando un gran taladro 25 ml pipeta y pasar el sobrenadante a través de un filtro invertido 70 micras. Enjuague los islotes en una placa de Petri de 10 cm por 10 medios de comunicación de pipeteo islotes ml a través del filtro mientras la mantiene boca arriba sobre el plato. Cultura los islotes en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejido hasta que esté listo para la experimentación. Por lo general, los islotes son recogidos a mano y contó antes de experimentation. 3. Los resultados representativos Los rendimientos de los islotes, la morfología y la calidad son los parámetros generales utilizados para juzgar el éxito de aislamiento de islotes. En nuestras manos, los rendimientos de los islotes a partir de la media de C57BL / 6 mouse están en el intervalo de 150-250 islotes que utilizan este protocolo (véase la Tabla 2), y son comparables con los obtenidos mediante optimizada Sigma tipo XI colagenasa. Sin embargo, los rendimientos pueden variar dependiendo de la cepa de ratón utilizada y la edad del ratón. La mayoría de los animales que utilizamos son en el rango de edad de 8-16 semanas Este protocolo ha sido probado en múltiples cepas de ratón, incluyendo C57BL / 6 (180 a 250 islotes / ratón), CD1 (200-300 islotes / ratón), 129 / B6 (200-300 islotes / ratón), BLKS-db/db (120-200 islotes / ratón), NOD (10 semanas de edad, 100-150 islotes / ratón), y NOD-SCID (100-150 islotes / ratón ). Morfología de los islotes típico se muestra en la Figura 2, en la que los islotes tienen una forma redonda a oblonga con un tamaño relativamente uniforme (aunque el tamaño UNIFormity puede variar de una cepa a otra). La Figura 3 muestra el análisis típico de la glucosa estimulada por la secreción de insulina de ratones C57BL / 6 islotes aislados de ratón purificados utilizando TDEs vs Sigma colagenasa tipo XI. Típicamente, una alta calidad de los resultados de la preparación de islotes en una estimulación de la insulina a la glucosa 25 mM que es 6-20 veces mayor que la observada en glucosa 2,5 mM. Otras aplicaciones también puede ser utilizado para probar la calidad de los islotes aislados, y éstos incluyen el uso de técnicas de perifusión, Ca 2 + de imágenes (con Fura2), y la transcripción inversa-PCR, entre otros 11. Figura 1. Un resumen de la canulación del conducto biliar. Figura 2. Aspecto típico de islotes C57BL / 6 a las 24 horas aislamiento siguiente. Las imágenes fueron adquiridas en una deverted microscopio con un aumento de 40X. Figura 3. Glucosa estimulada por la secreción de insulina de ratones C57BL / 6 islotes. En aislamiento hr 24 siguiente, 100 islotes se incubaron en una placa de 12-así durante 1 hora a 37 ° C en solución de Krebs-Ringer tamponada con HEPES solución que contiene 2,5 mM de glucosa. Los islotes se transfirieron entonces a Krebs-Ringer HEPES a 2,5 mM de glucosa por una hora adicional, después de lo cual se recogió el sobrenadante para la medición de la insulina utilizando una de dos sitios inmunoespecífica ligado a enzimas (ELISA) (Crystal Chem). Los islotes mismos posteriormente se transfirieron a solución de Krebs-Ringer tamponada con HEPES que contiene 25 mM de glucosa, y la liberación de insulina en el medio se midió por ELISA después de 1 h de incubación.