تنقية من الفجوات المرضي من<em> البكتيريا</em> المصابة البالعات
Summary
توضح هذه المقالة طريقة لعزل وتنقية سليمة<em> البكتيريا</em> التي تحتوي على فجوات (LCVs) من الاميبا والضامة. البروتوكول على مرحلتين تشمل تخصيب LCV بواسطة المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة LCV البكتيرية وتنقية المزيد من الطرد المركزي المتدرج الكثافة.
Abstract
والانتهازية الممرض الفيلقية المستروحة هو جرثومة الاميبا المقاوم، والذي يتطابق أيضا في الضامة السنخية وبذلك يكون الالتهاب الرئوي "داء الفيالقة" (1). في البالعات الأوالي والثدييات، L. بنوموفيلا توظف آلية الحفظ على تشكيل معين، والنسخ، متساهل مقصورة، و "البكتيريا التي تحتوي على فجوة" (LCV). LCV تشكيل يتطلب البكتيرية ICM / نقطة إفراز الرابع نوع النظام (T4SS)، والتي translocates ما يصل الى 275 "المستجيب" البروتينات في الخلايا المضيفة. والمستجيبات التلاعب البروتينات المضيفة، وكذلك نسبة الدهون والتواصل مع إفرازي، العضيات endosomal والميتوكوندريا 2-4.
تشكيل LCVs يمثل عملية معقدة وقوية وزائدة عن الحاجة، والتي من الصعب فهم بطريقة اختزالية. مطلوب نهج تكاملي لفهم شامل تشكيل LCV، بما في ذلك تحليل عالمي للمسارالتفاعلات عامل ogen في استضافة وديناميتها الزمانية والمكانية. وذلك كخطوة أولى نحو تحقيق هذا الهدف، وتنقيته LCVs سليمة وتحليلها بواسطة البروتيوميات وlipidomics.
وقد تم التحقيق في تكوين وتشكيل الممرض المحتوية على فجوات بواسطة تحليل البروتين باستخدام اللوني السائل أو 2 مد هلام الكهربائي بالإضافة إلى مطياف الكتلة. آوى فجوات معزولة عن إما discoideum التربة الاجتماعية Dictyostelium الأميبا أو البالعات الثدييات الليشمانيا 5، 6 الليستيريا، المتفطرة 7، Rhodococcus 8، 9 أو السالمونيلا النيابة البكتيريا. 10. ومع ذلك، فإن البروتوكولات المستخدمة في تنقية هذه الدراسات وقتا طويلا ومملا، لأنها تتطلب على سبيل المثال المجهر الإلكتروني لتحليل LCV مورفولوجيا والنزاهة والطهارة. بالإضافة إلى ذلك، هذه البروتوكولات لا استغلال الميزات الخاصة للفجوة الممرض لENrichment.
الطريقة المعروضة هنا يتغلب على هذه القيود من خلال توظيف دال discoideum المنتجة للعلامة LCV الفلورسنت وذلك عن طريق استهداف البكتيرية صدق بروتين المستجيب، الذي انتقائي المراسي لغشاء LCV عن طريق الربط بين فوسفتيدلينوستول 4-الفوسفات (PtdIns (4) P) 3،11. يتم إثراء LCVs في خطوة أولى من قبل المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام جسم مضاد الانجذاب-تنقية الابتدائية ضد صدق والأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى حبات المغناطيسي، ثم في مرحلة ثانية من قبل الطرد المركزي Histodenz الكلاسيكية التدرج الكثافة 12،13 (الشكل 1) .
دراسة بروتيوم من LCVs المعزولة من د. وكشفت discoideum أكثر من 560 بروتينات الخلية المضيفة، بما في ذلك البروتينات المرتبطة الحويصلات البلعمية، الميتوكوندريا، وأوروبا وجولجي، وكذلك GTPases عدة، والتي لم تكن قد تورطت في تشكيل LCV قبل 13. LCVs التخصيب وتنقيته معحدد بروتوكول هنا يمكن تحليل مزيد من الفحص المجهري (المناعي، المجهر الإلكتروني)، طرق كيميائية حيوية (الغربية وصمة عار) والنهج البروتين أو lipidomic.
Protocol
Discussion
وعلى النقيض من الأساليب المنشورة سابقا، ويستند هذا البروتوكول على خطوتين، لأول مرة فصل LCVs بواسطة نهج المناعية المغناطيسي، والثانية، وتنقية من LCVs بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة. ويمكن عزل LCV اتباعها بسهولة بواسطة المجهر مضان، عندما يتم استخدام أي من البكتيريا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم البحوث في المختبر من قبل معهد ماكس فون بيتنكوفر، لودفيج ماكسيميليان ميونيخ الجامعة، ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG، مرحبا 1511/3-1)، والفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF) "الجينوم العدوى الطبية" مبادرة ( 0315834C).
References
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
