הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים
Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.
Abstract
יש גוף משמעותי של ראיות מצביעות על כך שתאי עצב חדשים נוצרים באופן פונקציונלי constitutively מברכת אנדוגני בתאי גזע עצביים באזורים מוגבלים של המוח של יונקי הבוגרים. neuroblasts יילוד מאזור subventricular (SVZ) נודד לאורך הנחל הנודד המקורי (RMS) ליעד הסופי שלהם בנורת חוש הריח (OB) 1. בRMS, neuroblasts להעביר באופן כלשהו ברשתות ensheathed ידי תהליכי astrocytic 2,3 באמצעות כלי דם כתמיכה מבנית ומקור לגורמים מולקולריים הנדרשים להגירת 4,5. בOB, neuroblasts להתנתק מהכבלים ולהעביר רדיאלית לשכבות השונות המוח המאורך שבו הם להתמיין לinterneurons ולהשתלב ברשת הקיימת 1, 6.
בכתב יד זה יתאר את ההליך לנדידת תאי ניטור בפרוסות חריפות של המוח המכרסם. השימוש בפרוסות חריפות מאפשר assessmאף אוזן גרון של נדידת תאים בmicroenvironment שדומה מאוד לתנאי vivo ובאזורים במוח שקשה לגשת לדימות vivo. בנוסף, זה ימנע מצב culturing ארוך כמו במקרה של תרבויות organotypic ותא שסופו של דבר עשוי לשנות את מאפייני הנדידה של התאים. מבשרי נוירונים בפרוסות חריפות ניתן דמיינו באמצעות אופטיקה DIC או חלבוני ניאון. תיוג הנגיפי של מבשרי נוירונים בSVZ, השתלת neuroblasts מעכברי כתב לתוך SVZ של עכברי סוג פראי, ושימוש בעכברים מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בneuroblasts כל השיטות המתאימות להמחשת neuroblasts ולאחר הגירתם. שיטה האחרת, לעומת זאת, אינה מאפשרת לתאים בודדים להיות במעקב במשך תקופות זמן ארוכים, בגלל הצפיפות הגבוהה של תאים שכותרתו. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ זקוף ניאון שדה רחב מצויד במצלמת CCD להשיג מרווח רכישה מהירה יחסית (1 image כל 15 או 30 שניות) באופן מהימן לזהות הנייח ושלבים נודדים. זיהוי מדויק של משך השלבים הנייחים ונדידה הוא חיוני לפרשנות חד המשמעית של תוצאות. גם בצענו רכישות מרובות z שלב כדי לפקח הגירת neuroblasts ב-3D. הדמית ניאון שדה רחב כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש נדידה עצבית 7-10. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתיוג neuroblasts, ביצוע וידאו בזמן אמת הדמיה של הגירת neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי העכבר המבוגר, וניתוח נדידת תאים. בעוד הפרוטוקול המתואר הודגם ההגירה של neuroblasts במבוגר RMS, זה יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר נדידת תאים במוח לאחר לידה עוברי ומוקדם.
Protocol
Discussion
המיקוד הנכון של מבשרי נוירונים לאזורי המוח המתאימים הוא תהליך יסוד של ההרכבה והתפקוד התקין של מעגלים עצביים. הרוב המכריע של תאים נודדים במהלך התפתחות עוברית ובמוח לאחר הלידה רק בכמה אזורים, כגון gyrus OB, המשונן ומוח הקטן, התזוזה עצבית עדיין מתרחשת. המנגנונים מנצחים נדי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכון קנדי לבריאות מחקר (CIHR) המענק לASJK מומן בהחלק על ידי מלגת אוול אוניברסיטה. AS הוא הנמען של קנדה מחקר קתדרת neurogenesis לאחר הלידה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
| NaCI | Sigma | S9625 |
| KCI | Sigma | P9541 |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| HBSS | Gibco | 14170-112 |
| DNase I | Sigma | D-5025 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| BSA | EMD | 2930 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
| Suture | Stoelting | 50487 |
| Anafen | CDMV | 11508 |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
| Petri dish | VWR | 25384-094 |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
| Glue | Permabond | 910 |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
| Blade | WPI | 501901 |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
| Micro drill system | WPI | 501819 |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
