Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

1. De alta presión de congelación Preparar la crio-protector mediante la adición de 0,2 g de BSA en 1 ml de un medio apropiado para su espécimen (por ejemplo, medio de cultivo para los cultivos celulares, M9 de C. elegans). Incubar el tubo en un baño a 37 ° C hasta que se disuelve todo el BSA. Antes de la congelación, llene el automatizadas de congelación-sustitución dispositivo (Leica AFS) con nitrógeno líquido Ajuste el programa AFS: -90 ° C durante 5-30 horas *, 5 ° C / hr a -60 ° C, -60 ° C durante 2 horas (o seleccione "pausa" opción si está utilizando Leica AFS 2), 5 ° C / hr a -30 ° C y -30 ° C durante 72 hr. Si la máquina AFS es capaz de tener más de cinco pasos, el paso de -30 ° C debe ser sustituida por una "pausa" opción se ajusta a 0 horas, y dos nuevas medidas debe añadirse: 10 ° C / hr a -20 ° C y 24 horas a -20 ° C. Si la máquina está limitado a cinco pasos, configurar otro programa en otra ranura de memoria de la siguiente manera: 10 ° C / hr a -20 ° C y 24 hr a -20 ° C. * El tiempo de aquí se puede ajustar de manera que el paso -60 ° C comienza temprano en la mañana. Preparar 1% de tetróxido de osmio solución stock mediante la mezcla de 0,1 g de cristales de tetróxido de osmio (EMS, RT19134) con 10 ml de acetona anhidra (EMS, # RT10016). Preparar los fijadores en un tubo cónico de 50 ml como sigue. En primer lugar, añadir 1 ml de agua MilliQ, y luego se disuelven en ella 0,02 g de permanganato de potasio (EMS, RT20200). Añadir 19 ml de acetona y se mezcla bien. Finalmente, añadir 20 l de solución stock de osmio al 1% en el tubo. La acetona es un limpiador de radicales libres 11 y por lo tanto impide la polimerización de plástico, pero el uso de acetona como un medio de congelación-sustitución es necesario para preservar la morfología debido a su interacción con los lípidos. La acetona se sustituirá con etanol antes de la infiltración de plástico. Alícuota de 1 ml para cada criovial y mantener los fijadores congelados mediante el almacenamiento de los tubos en nitrógeno líquido. Llenar un portador de muestras con 20% de BSA o bacterias.Tanto BSA 20% y bacterias sirven como crio-protectores. La elección para el tipo de portador de muestras depende de la muestra. Para C. elegans, utilice unas 100 micras bien. Colocar la muestra en el soporte y congelarlo usando un congelador de alta presión. Después de la congelación y en atmósfera de nitrógeno líquido, transferir la muestra en el tubo criogénico que contiene fijadores. Asegúrese de que la muestra se mantiene bajo el líquido en todo momento. Repita 1,5) – 1,7) hasta que todas las muestras se congelan. Transfiera todos los criotubos en la unidad de AFS, y reanudar el programa. 2. Freeze-sustitución Cuando la temperatura alcanza los -60 ° C, los viales que contienen 20 ml lugar de 95% de acetona en la AFS. Cuando la temperatura alcanza los -50 ° C, sustituir los fijadores con 95% de acetona seis veces durante el período de 2 hr. Colocar un vial que contiene 20 ml de acetato de uranilo al 0,1% (Polysciences, # 21447 a 25) en 95% de acetona en la cámara ypre-enfriado a -50 ° C. Al final de la etapa de lavado, añadir ~ 1 ml de solución de acetato de uranilo a cada vial. Reanudar el programa si es necesario. Cuando la temperatura alcanza los -30 ° C, sustituir el acetato de uranilo con 95% de etanol seis veces durante el período de 2 hr. Mientras tanto, el 97% de resina de metacrilato de glicol (GMA, SPI Supplies / Structure Probe, Inc., # 02630-AA) por mezcla de 22,3 ml de GMA, 10 ml de n-butilo, metacrilato de 1 ml de agua MilliQ, y 0,2 g de peróxido de benzoilo (catalizador). Almacenar en viales de vidrio (EMS, # 72632) y 30% de GMA preparar mediante la mezcla con 95% de etanol. No almacenar medios de GMA en tubos de plástico porque la calidad de polimerización se degrada con el almacenamiento a largo plazo en polietileno a base de plásticos. Pre-enfriar la GMA solución a -30 ° C. Resinas epoxi tradicionales tales como Araldite y Epon no se puede utilizar en el protocolo, ya que son anhidro y ácido que apaga las proteínas fluorescentes. Resinas acrílicas, tales como LR White, cuna tolerar una pequeña cantidad de agua y se puede preservar la proteína fluorescente, pero su pH ácido tiende a apagar el fluoróforo 12. GMA tolera, de hecho, requiere, una pequeña cantidad de agua y es alcalino (pH 8) 12. GMA es por desgracia algo frágil. Por otra parte, GMA no reticulación con los tejidos como las resinas epoxi tradicionales. Estas características de incompatibilidad causa GMA en seccionar calidad especialmente cuando seccionada más delgada que 80 nm. Aunque la vida útil de GMA es de aproximadamente un año, GMA se debe utilizar dentro de los 3 meses de la compra para asegurar su calidad. 3. La infiltración y la polimerización Pasos 3.1-3.3 se llevan a cabo en las mismas utilizadas para crioviales de congelación-sustitución. La infiltración y la polimerización se lleva a cabo a -30 ° C en la AFS para preservar la proteína fluorescente. Preparar los medios de infiltración mediante la mezcla de la solución madre de GMA con 95% de etanol. Incubar las muestrasen 30% de GMA para 3-5 hr. Incubar las muestras en 70% de GMA para 4-6 hr. Incubar las muestras en 97% de GMA durante la noche. En el día siguiente, constituyen fresco 97% de GMA. Transferir las muestras a un molde de inclusión (EBSciences, # TC). Prepare un disco de película ACLAR (EMS, # 50425 a 10) mediante el uso de un 3/8 "DISC Punch (Ted Pella Inc.) y coloque el disco en la parte inferior de la cápsula BEEM. Cambio del 97% de GMA tres veces durante 6 horas a -30 º C. Después del intercambio tercero, añadir el iniciador N, N-dimetil-p-toluidina-(Sigma-Aldrich, # D9912) de GMA a una concentración de 1,5 l / GMA 1 ml y aplicar esta solución a cada molde de la muestra. Inmediatamente colocar la muestra en el molde de inclusión en la AFS. Tenga en cuenta que el peróxido de benzoilo es el catalizador y está presente en todas las fases de infiltración por lo agitación no es necesario. El peróxido de benzoilo no polimeriza el plástico hasta que se expone al iniciador químico N, N-dimetil-p-toluidina. El iniciador activa polymerization inmediatamente y se polimeriza la resina incluso en los tejidos dentro de 1 hr. Sin embargo, los abandonos del tejido puede resultar en tejidos profundos, debido a la polimerización incompleta. Además, GMA no reticular el espécimen al bloque y, por lo separar la muestra del crioprotector dando golpecitos en la matriz de las bacterias. Si la polimerización se lleva a cabo fuera de un AFS, el molde de inclusión debe ser cubierto con un disco aclar para bloquear la exposición al oxígeno. GMA no se polimeriza completamente cuando se expone al oxígeno. Permitir que el plástico se cure durante la noche a pesar de que se polimeriza dentro de 1 hr. Almacenar la muestra en una bolsa de nitrógeno vacío lleno de gas (Ziploc) en el congelador (-20 ° C) hasta su procesamiento posterior de modo que las proteínas fluorescentes no están expuestos al oxígeno. 4. Seccionamiento Seccionamiento de GMA-incrustados de puede llevar a cabo de una manera similar a la de Epon embebido en especímenes. Precaución adicional se debe tomarn de no mojar la superficie de seccionamiento porque GMA es muy hidrófilo y las cintas será impulsado en el baño de agua si se humedecen en ambos lados. Recoger las cintas de las secciones (50-80 nm) en un cubreobjetos de vidrio en caso de un microscopio TIRF está siendo utilizado para la localización. De lo contrario, utilice una rejilla hecha por microscopía electrónica de transmisión. La velocidad de corte debe ajustarse at1.6 mm / s o superior. De lo contrario, una cinta no pueden formar. Secciones Almacenar a -20 ° C si no reflejado inmediatamente. Proteger los fluoróforos de la luz UV, cubriendo los titulares de la sección con papel de aluminio. 5. PALM imágenes Configure el microscopio PALM acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La temperatura de una cámara EMCCD se debe establecer en -70 ° C o por debajo. Aplicar partículas de oro (# 790122-010 – 2x concentrado, microesferas-nanospheres.com) en solución (aproximadamente 50 l) a la muestra que se va a examinar. Deje que la solución repose durante 30 segundos en las portadaslabio mientras que en un caso de la cubierta negro. Quitar la solución de oro por soplado hasta el borde del cubreobjetos y absorbente con un Kimwipe. Insertar el cubreobjetos en un soporte para el cubreobjetos circular. Si es necesario, aplicar grasa de vacío a la llanta para mantener el cubreobjetos en su lugar. Aplicar el aceite de inmersión para la parte inferior del cubreobjetos, directamente debajo de las muestras. Insertar el soporte de muestras en la ranura de la platina del microscopio. Tenga especial cuidado de no tocar los objetivos. Ajuste el soporte de manera que quede bien apretado y centra los apartados anteriores el objetivo. Busque las secciones usando una lente de objetivo de 10x. Cambie a la lente del objetivo 100x. Centrarse en la muestra. Localizar una región de interés mediante la observación de la fuerza de las señales de fluorescencia. Utilizar el láser de 488 nm y aumentar la intensidad en el menú Canales a 10%. Concéntrese en las áreas de fluorescencia más brillante. Tenga en cuenta que este paso no es necesario si el o regiónf interés pueden ser identificadas en el campo brillante por ojo. Encienda el láser a 561 nm y aumentar la intensidad hasta el 100% para blanquear la autofluorescencia del fondo. Bleach la muestra de ~ 2 min. Si el foco cambia durante el blanqueado, dejar 5 minutos que debe transcurrir antes de ajustar el enfoque y la captura de imágenes. Esta pausa permite que la temperatura se estabilice. Si el ámbito PALM está equipado con una cámara de incubación, ajustar la temperatura a 20 ° C y espere a ~ 2 hr para estabilizar las temperaturas en la cámara. Cuando el blanqueamiento es completa, activa el láser de 405 nm y la puso a la intensidad más baja. Comience a recoger las imágenes a 20 cuadros por segundo. Que generalmente se recopilan 5,000-6,000 cuadros por experimento, pero el número de cuadros debe ser ajustada en función del objetivo del experimento. Por ejemplo, si todas las proteínas en una región de interés debe ser reflejado, el número de trama se debe aumentar. Si las señales son escasas o débiles, poco a poco increasí la intensidad de 405 nm láser. Durante el proceso de adquisición, asegúrese de mantener las muestras en el foco ajustando cuidadosamente la perilla según sea necesario. Cuando las imágenes se recogieron, el análisis de palma debe ser realizado. Para tdEos, vamos a filtrar cualquier señal que fluorescen más de 500 mseg porque dichas señales son probablemente debido a la autofluorescencia. 6. Imagen SEM Antes de la formación de imágenes SEM, mancha de las secciones utilizando 2,5% de acetato de uranilo (en agua) durante 4 min. Lavar el acetato de uranilo a fondo con agua filtrada milliQ. Después de que las secciones se secan, carbono-coat el cubreobjetos usando un carbono por bombardeo iónico hasta que el cubreobjetos se vuelve bastante oscuro. Aplicar un extremo de la cinta de carbón conductor en el borde del cubreobjetos y el otro extremo en el talón de metal, de modo que los electrones que se acumulan en la superficie del cubreobjetos están conectados a tierra. Montar la muestra en la cámara de SEM (FEI Nova Nano). Inserte el detector VCD. </li> Cerrar la cubeta y bombearlo con el ajuste alto vacío. Una vez evacuado, abrir la válvula de columna de modo que un haz de electrones se aplica a una muestra. Para alinear la rutina de haz de electrones. Busque la muestra. Una vez que el enfoque se ajusta, vincular la platina y criar a un escenario a 5 mm por debajo de la pieza polar. Tome una imagen de bajo aumento de la muestra (~ 5.000 x). Zoom en la región de los intereses y obtener una gran ampliación (50.000 x) imágenes. Vaya a la sección siguiente, y repita el paso 6,10) y 6,11) hasta que todas las secciones se va a examinar. 7. Alineación de palma y EM Imágenes Abrir Photoshop y las imágenes adquiridas SEM. Crear una nueva ventana con unas dimensiones de 5.000 x 5.000 píxeles y 300 píxeles / pulgada de resolución. Copie el bajo aumento imagen SEM en la nueva ventana (Figura 1A). Escala la imagen para que se llenetoda la ventana a través de la manipulación de transformación (Comando + T para un Mac). Copie el mayor aumento SEM imágenes y ampliar cuando sea necesario. Girar la imagen TIRF suma horizontalmente seleccionando rotación de imagen en la barra de menú imagen desplegable. Copiar y pegar la imagen TIRF suma (de PALM) en una nueva capa. Escala de la imagen usando la transformada de manipulación y, a continuación girar según sea necesario para que coincida con la fluorescencia de las partículas de oro (flechas blancas en la Figura 1A) con las correspondientes estructuras visualizadas en SEM (Figura 1B). Copie la imagen de PALM en una nueva capa y aplicar la misma transformación (Figura 1 C). Una ampliación de imagen superior se puede extraer de esta imagen (Figura 2). Para la presentación, copie la imagen PALM transformado en una nueva capa. Seleccione las señales de palma, pero no a fondo usando "gama de colores" en la "selección" en el menú desplegable. Asegúrese de selejar un píxel del fondo como un píxel de referencia y activar la opción "invertir" opción. Cortar las señales PALM deseados y pegarlos en una nueva capa. Aplicar transparencia a la capa de fondo, y lo puso a un 10%. Esto permite la visualización de las señales de palma, por lo que el fondo transparente sin comprometer su intensidad (Figura 2D). 8. Los resultados representativos Histona etiquetados con tdEos puede ser establemente expresada en el nematodo C. elegans, y los animales transgénicos se procesaron utilizando el protocolo descrito anteriormente. Las micrografías de electrones de palma y fueron adquiridos de la misma sección (Figura 1). Para alinear las imágenes, la imagen suma TIRF, que resume la fluorescencia durante el transcurso de tiempo completo, se superpone sobre la micrografía electrónica. Las nanopartículas de oro aparecen tanto en las micrografías de fluorescencia y electrónica y se puede utilizar para alinear las dos imágenes utilizando el transf 'función orm 'en Photoshop (Figura 1A y B). Entonces, el valor de la misma "transformar" se aplica a la imagen de la palma (Figura 1C). Con este aumento, el detalle estructural no se pueden distinguir, por lo que has en una región cerca del extremo superior de la micrografía (Figura 2). En la imagen de alta magnificación, detalles subcelulares como un núcleo, un nucléolo, poros nucleares, y retículo endoplásmico se puede observar. Además, las moléculas marcadas de histonas son exclusivamente localizado en el núcleo, pero no para el nucleolo, como se esperaba. La microscopía correlativa PALM y el electrón por tanto permite la localización de proteínas en la resolución más alta. Cinco problemas pueden comprometer la calidad de las imágenes. En primer lugar, el daño de cristales de hielo pueden distorsionar ultraestructura (Figura 3A y B). La colocación de las muestras en una bacteria crio-protectores, tales como, lo que reduce la propagación de los cristales de hielo, puede reducir este daño. Sin embargo,todavía hay que cribar muestras mediante microscopía electrónica y descartar aquellos con artefactos de congelación. En segundo lugar, GMA no reticular a los tejidos como las resinas epoxi, y por lo tanto las muestras a menudo liberarse del plástico que rodea y estirar, encoger o incluso caerse de la sección (Figura 3C y D). La disección de la muestra lejos de las bacterias o de otros crio-protector antes de clavarse proporciona una mayor adherencia del plástico a la muestra (Figura 3C). De manera similar, las estructuras tales como las gotas de lípidos en el intestino a menudo se disocian de los tejidos debido a la ausencia de reticulación (Figura 3E). En tercer lugar, la polimerización incompleta de las causas de estiramiento plástico o plegado de tejidos (Figura 3F), la presencia de oxígeno en la muestra también impide la polimerización de GMA. En cuarto lugar, la mala calidad de seccionamiento de GMA a menudo resulta en una morfología incompatible (Figura 3G y H). GMA secciones se deben cortar en70 nm o más grueso y a una velocidad de alrededor de 1,6 mm / s para minimizar los artefactos de seccionamiento. En quinto lugar, la autofluorescencia de fondo de polvo en el cubreobjetos o sección es inevitable. Autofluorescencia del polvo puede ser minimizado mediante el uso de prelavados cubreobjetos y evitar la contaminación por el polvo de Kimwipes y papel de filtro como se describe en el protocolo. El programa de análisis de palma puede editar las señales de la muestra o de plástico que emiten fluorescencia ya que las señales típicas de proteínas fluorescentes (Figura 2 A y B). La imagen final será por lo tanto libre de tales artefactos. Figura 1. Alineación de micrografías de fluorescencia y electrónica que utilizan nanopartículas de oro. (A) Un aumento bajo micrografía electrónica de una sección transversal de C. elegans expresan los tdEos etiquetados histonas :: SU-11. Blanca unarrows indican 100 nm electrones de alta densidad nanopartículas de oro aplicado antes de la proyección de imagen PALM que sirven como puntos de referencia. (B) Las perlas de oro fluorescencia tras la exposición a la luz ~ 580 nm y crear marcas de referencia en la imagen de fluorescencia. La imagen de suma TIRF está alineado en una micrografía electrónica basándose en la ubicación de las marcas fiduciales. La imagen de suma TIRF representa todos los fotones detectados por la cámara durante el transcurso de tiempo experimental. Tenga en cuenta que los puntos brillantes en la parte superior izquierda (flecha blanca) surgen de los racimos de partículas de oro. (C) Una imagen PALM se añade a la micrografía electrónica y gira y se traduce según los valores determinados a partir de la alineación de la imagen TIRF suma en (B). Haga clic aquí para ampliar la cifra . <br /> Figura 2. Correlativa nano-FEM utilizando proteínas histonas fusión. (A) Suma de imagen TIRF tdEos :: SU-11 adquiridos de una sección delgada (70 nm). (B) Imagen PALM correspondiente de tdEos :: SU-11. Autofluorescencia (flecha blanca) que dura más de 500 mseg se filtró a cabo por el programa de PALM. (C) Micrografía electrónica de un núcleo adquirido de la misma sección. (D) Imagen PALM correlativa y micrografía electrónica de tdEos :: SU-11. La fluorescencia se localiza firmemente a la cromatina en el núcleo. Figura 3. Problemas asociados con nano fem. (A) Micrografía electrónica de una C. elegans músculo del cuerpo sin dañar los cristales de hielo. (B) Micrografía electrónica de un cuerpo muscular con el daño del cristal de hielo. En lugar de discretos secciones transversales, filamentos de actina y miosina se colapsan en agregados debido a la formación de cristales de hielo. (C, D) Bajo aumento micrografía electrónicas, que muestra la disociación de los gusanos de los medios circundantes. La sección es más distorsionada en una muestra que está rodeado por las bacterias crio-protectores (D) que cuando la muestra está rodeado por el plástico (C). La crio-protector bacteriano en el gallette debe ser disecados fuera de la muestra fijada antes de la incrustación de plástico. Tenga en cuenta que el animal a la derecha en (D) fue seccionado oblicuamente, y por lo tanto la forma no es debido a la distorsión de los tejidos. (E) Micrografía electrónica de intestino, que muestra los abandonos de tejidos (flechas negras). (F) Micrografía electrónica de anillo nervioso, que muestra secciones de plegado debido a la polimerización incompleta de plástico (flechas negras). (G, H) micrografías de electrones neuronas a partir de la misma muestra, seccionadas en diferentes fechas. La preservación de los tejidos es magnífica en un día (G), pero tal morfología es oscurecida por la calidad de seccionamiento inconsistente (H). Haga clic aquí para view mayor cifra.