Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

1. Высокого давления Замораживание Подготовка крио-защитным добавлением 0,2 г БСА в 1 мл соответствующей среды для вашего образца (например, питательной среды для культур клеток, M9 для C. Элеганс). Инкубируйте пробирку при 37 ° С водяной бане, пока все BSA не растворится. До замораживания, заполните автоматизированной замораживание-замещение устройство (Leica AFS) с жидким азотом Установите программу AFS: -90 ° C в течение 5-30 * ч, 5 ° С / ч до -60 ° C, -60 ° C в течение 2 часов (или выберите "пауза", если Вы используете Leica AFS 2), 5 ° С / ч до -30 ° C и -30 ° C в течение 72 часов. Если машина AFS способна иметь более чем на пять шагов, -30 ° C шаг должен быть заменен на "паузу" опция установлена ​​в 0 час, и два дальнейшие шаги должны быть добавлены: 10 ° C / ч до -20 ° C и 24 ч при температуре -20 ° C. Если машина ограничена пятью шагами, создать другую программу в другой слот для карт памяти следующим образом: 10 ° C / ч до -20 ° C и 24 чг при температуре -20 ° C. * Время здесь может быть отрегулирован так, чтобы -60 ° C шаг начинается с раннего утра. Подготовьте 1% осмия раствор путем смешивания 0,1 г осмия кристаллов (EMS, RT19134) с 10 мл безводного ацетона (EMS, # RT10016). Подготовка фиксаторов в 50 мл коническую трубку следующим образом. Во-первых, добавьте 1 мл воды MilliQ, а затем раствориться в нем 0,02 г перманганата калия (EMS, RT20200). Добавить 19 мл ацетона и хорошо перемешать. Наконец, добавьте 20 мл 1% раствора осмия в трубку. Ацетон свободных радикалов 11 и тем самым препятствует полимеризации пластика, но использование ацетона в качестве замораживание-замещение среде необходимо для сохранения морфологии из-за его взаимодействия с липидами. Ацетон будет замещен этанолом до пластиковых инфильтрации. Алиготе 1 мл каждого криопробирку и держать фиксаторов заморожены хранение труб в жидком азоте. Заполните образца носитель с 20% BSA или бактерий.И 20% BSA и бактерии служат крио-протравителей. Выбор по типу образца носителя зависит от образца. Для C. Элеганс, используйте 100 мкм хорошо. Поместите образец в держателе и заморозить его с помощью высокого давления, морозильная камера. После замораживания и под жидким азотом, передает образца в криоскопической пробирки содержащие фиксаторов. Убедитесь, что экземпляр остается в жидком во все времена. Повторите 1,5) – 1,7), пока все образцы заморожены. Перенесите все криопробирок в блок AFS, и возобновить программу. 2. Freeze-замена Когда температура достигает -60 ° C, место флаконах, содержащих по 20 мл 95% ацетона в AFS. Когда температура достигает -50 ° C, замените фиксаторы с 95% ацетона в шесть раз на протяжении 2 часов. Поместите флакон, содержащий 20 мл 0,1% уранилацетата (Polysciences, # 21447-25) в 95% ацетона в камеру ипредварительно охладить его до -50 ° C. В конце промывки, добавить ~ 1 мл раствора ацетата уранила в каждом флаконе. Возобновить программы в случае необходимости. Когда температура достигает -30 ° C, замените уранилацетата с 95% этанола в шесть раз за период 2 часа. В то же время, составляют 97% смолы гликоля метакрилата (GMA, SPI Supplies / Структура Probe, Inc # 02630-AA) путем смешивания 22,3 мл GMA, 10 мл н-бутилметакрилата, 1 мл MilliQ воде, и 0,2 г перекиси бензоила (катализатор). Хранить в стеклянных флаконах (EMS, # 72632) и подготовить 30% GMA путем смешивания его с 95% этанола. Не храните GMA СМИ в пластиковых пробирках, потому что качество полимеризации снижается с длительного хранения в полиэтиленовой основе пластмасс. Предварительное охлаждение решение GMA до -30 ° C. Традиционные эпоксидных смол, такие как Araldite и Epon не могут быть использованы в протоколе, поскольку они являются безводные и кислой который гасит флуоресцентных белков. Акриловые смолы, такие как LR белый, смириться с небольшим количеством воды и может сохранить флуоресцентного белка, но его кислом рН стремится утолить флуорофора 12. GMA терпит, на самом деле требует небольшого количества воды и щелочной (рН 8) 12. GMA, к сожалению, довольно хрупкое. Кроме того, GMA не поперечные связи с тканями, как традиционных эпоксидных смол делать. Эти характеристики несоответствие причины GMA в секционирования качество, особенно при сечении тоньше, чем 80 нм. Хотя срок годности GMA около года, GMA должны быть использованы в течение 3 месяцев после покупки обеспечить его качество. 3. Инфильтрация и полимеризации Шаги 3.1-3.3 осуществляются в том же криопробирки используется для замораживания замещения. Инфильтрация и полимеризация осуществляется при -30 ° C в AFS сохранить флуоресцентного белка. Подготовка проникновение средств массовой информации путем смешивания решение GMA акции с 95% этанола. Инкубируйте образцыВ 30% GMA течение 3-5 часов. Инкубируйте образцов в 70% GMA течение 4-6 часов. Инкубируйте образцов в 97% GMA ночь. На следующий день, составляет 97% свежего GMA. Передача образцов для вложения плесень (EBSciences, # TC). Подготовка диска фильма ACLAR (EMS, # 50425-10) с помощью 3/8 "DISC Punch (Ted Pella Inc) и поместите диск в нижней части капсулы BEEM. Биржи 97% GMA три раза в течение 6 часов при -30 ° C. После третьего курса, добавить инициатором N, N-диметил-п-толуидин (Sigma-Aldrich, # D9912) для GMA в концентрации 1,5 мкл / 1 мл GMA и применить это решение для каждого образца формы. Сразу положение образца в форме вложения в AFS. Обратите внимание, что перекись бензоила является катализатором и присутствует во всех инфильтрации шаги, чтобы перемешивание не требуется. Перекись бензоила не полимеризуется пластиковые, пока она подвергается химической инициатором N, N,-диметил-п-толуидин. Инициатором активирует полиymerization сразу и полимеризации смолы даже в тканях в течение 1 часа. Тем не менее, ткани отсева может привести к глубоким тканям из-за неполной полимеризации. Кроме того, GMA не сшивания образца в блок, так что отделить образца из криопротектора, нажав на матрице бактерий. Если полимеризация осуществляется за пределами AFS, вложение формы должны быть покрыты ACLAR диск, чтобы заблокировать воздействия кислорода. GMA не полимеризуется полностью при контакте с кислородом. Разрешить пластиковых вылечить в течение ночи, хотя он полимеризуется в течение 1 часа. Храните образец в азоте газовый вакуумный мешок (Ziploc) в морозильной камере (-20 ° C) до дальнейшей обработки, так что флуоресцентные белки не подвергаются воздействию кислорода. 4. Секционирование Секционирование GMA встраиваемый образцов может быть осуществлено аналогично, как и для EPON встраиваемый образцов. Дополнительные осторожностью следует приниматьп не замочить секционирования поверхности, так GMA очень гидрофильных и ленты будет приведен в ванну с водой, если они смачивают с обеих сторон. Сбор лентами секций (50-80 нм) на стекло покровное, если микроскоп TIRF используется для локализации. В противном случае, использовать сетку сделал для просвечивающей электронной микроскопии. Скорость резания должна быть установлена ​​at1.6 мм / с или выше. В противном случае лента не может образоваться. Магазин разделов при температуре -20 ° С, если не вошедшие немедленно. Защита флуорофоров от ультрафиолетового излучения, покрыв разделе держателей с алюминиевой фольгой. 5. PALM изображений Установить PALM микроскопа в соответствии с рекомендациями производителя. Температура EMCCD камеры должны быть установлены до -70 ° C или ниже. Применить частицами золота (# 790122-010 – 2x концентрированные, микросферы-nanospheres.com) в растворе (примерно 50 мкл) образца для включения в образ. Разрешить решение, чтобы сидеть в течение 30 секунд на обложкахгубы в то время как под черной крышке корпуса. Снимите золото решения путем продувки его к краю покровного стекла и поглощая его с Kimwipe. Вставьте покровное в круглую держатель покровное. При необходимости применяют вакуумные смазки на обод держать покровное на месте. Применить иммерсионного масла на нижней стороне покровного, прямо под образцов. Вставьте держатель образца в слот на сцене микроскопом. Соблюдайте особую осторожность и не прикасайтесь к цели. Отрегулируйте держатель так это жесткой и центры разделах выше цели. Найдите разделы, используя 10-кратным объективом. Перейдите в 100x объектива. Сосредоточьтесь на образце. Найдите область интереса, наблюдая за силой сигнала флуоресценции. С помощью 488 нм лазера и увеличить интенсивность в меню каналов на 10%. Сосредоточьтесь на области яркая флуоресценция. Обратите внимание, что этот шаг не является необходимым, если область ОF интерес, могут быть определены в светлом поле на глаз. Включите лазер на 561 нм и увеличение интенсивности до 100% для отбеливания из фона автофлуоресценции. Bleach образцом для ~ 2 мин. Если фокус изменения во время отбеливания, позволяющие 5 минут, по истечении настройки фокуса и захвата изображений. Эта пауза позволяет стабилизации температуры. Если объем PALM оснащен инкубационной камере, установите температуру на 20 ° C и ждать ~ 2 часа для стабилизации температуры в камере. При отбеливании завершения активации 405 нм лазером и установить его на низкую интенсивность. Начните собирать изображения со скоростью 20 кадров в секунду. Как правило, мы собираем 5000-6000 кадров в эксперименте, но количество кадров должна быть скорректирована в зависимости от цели эксперимента. Например, если все белки в интересующей области должна быть отображена, номер кадра должна быть увеличена. Если сигналы редкие или слабые, медленно increaSE 405 нм интенсивности лазерного излучения. Во время процесса приобретения, не забудьте сохранить образцы в фокус Тщательно регулируя ручку по мере необходимости. Когда изображения будут собраны, анализ PALM должны быть выполнены. Для ТДУС, мы отфильтровать любые сигналы, которые светятся более 500 мсек, потому что те сигналы, скорее всего, из-за автофлуоресценции. 6. СЭМ изображения До SEM изображения, пятна разделы, используя 2,5% уранилацетата (в воде) в течение 4 мин. Смыть уранилацетата тщательно фильтруется MilliQ воды. После раздела сушат, углерод-пальто покровное использованием углерода распыления до покровное становится довольно темно. Применить один конец углерода проводящей ленты на краю покровного стекла, а другой конец на металлической заглушкой, так что электроны, которые накапливаются на поверхности покровного заземлены. Установить образец в камеру SEM (FEI Nova Nano). Вставьте детектор VCD. </lI> Закройте камеру и накачать ее с помощью установки высокого вакуума. После эвакуированы, открыть колонку клапан так, чтобы пучок электронов наложении на образец. Выполнение рутинных выравнивание электронного пучка. Найдите образца. После того как фокусировка настраивается, связать образец этапе и довести до стадии до 5 мм ниже полюс. Возьмите низкой увеличенное изображение образца (~ 5000 х). Увеличить в области интереса и получить большое увеличение (50.000 х) изображений. Переход к следующему разделу, и повторите шаг 6,10) и 6,11), пока все разделы образа. 7. Выравнивание PALM и EM изображения Откройте Photoshop и приобрел SEM изображение. Создать новое окно с размерами 5000 х 5000 пикселей и 300 пикселей / дюйм. Скопируйте малом увеличении SEM изображение в новом окне (рис. 1А). Масштабирование изображения так, чтобы оно заполняетвсе окна с помощью манипуляций Transform (Ctrl + T для Mac). Скопируйте большем увеличении СЭМ изображения и масштабировать их по мере необходимости. Поворот изображения в сумме TIRF горизонтально, выбрав поворот изображения на картинке выпадающего меню. Скопируйте и вставьте изображение сумму TIRF (от PALM) в новый слой. Масштабирование изображения с помощью манипуляции преобразования, а затем вращайте по мере необходимости в соответствии с флуоресценции частиц золота (белые стрелки на рисунке 1а) с соответствующими структурами визуализированы в РЭМ (рис. 1б). Скопируйте PALM изображение на новый слой и применяем те же преобразования (рис. 1С). Большем увеличении изображение может быть извлечено из этого изображения (рис. 2). Для наглядности, скопируйте превращается PALM изображение в новый слой. Выберите PALM сигналы, но не фон с помощью "цветовой диапазон" в "Select" в раскрывающемся меню. Убедитесь в том, сельECT пикселя фона в качестве эталона пикселей и включите "инвертировать" вариант. Вырезать нужные сигналы PALM и вставьте их в новый слой. Применить прозрачность на фоновый слой, и установите его на 10%. Это позволяет для визуализации PALM сигналов, сделав фон прозрачным без ущерба для их интенсивности (рис. 2D). 8. Представитель Результаты Гистонов с тегом ТДУС может быть стабильно выражается в нематоды C. Элеганс, и трансгенные животные были обработаны с использованием протокола описаны выше. PALM и электронной микроскопии были получены из того же сечения (рис. 1). Для выравнивания изображения, изображение TIRF сумму, которая суммирует флуоресценции на всем протяжении времени, накладывается на электронной микрофотографии. Наночастицы золота появляются в обоих флуоресценции и электронного микроскопа и может быть использован для совмещения двух изображений с помощью "TransfORM "функции в Photoshop (рис. 1а и В). Тогда, значение же «преобразование» был применен к изображению PALM (рис. 1С). В этом увеличении, структурные детали, не могут быть выделены, так что мы увеличенной в области, близкой к верхней части микроскопа (рис. 2). В высоких увеличение изображения, субклеточном детали, такие как ядро, ядрышко, ядерные поры, и эндоплазматической сети не наблюдалось. Кроме того, в отмеченном гистонов молекулы локализован исключительно к ядру, но не к ядрышко, как ожидалось. Корреляционной микроскопии и электронной PALM таким образом, позволяет локализации белков в высоком разрешении. Пять проблемы могут повлиять на качество изображения. Во-первых, повреждения кристалла льда может исказить ультраструктуры (рис. 3А и B). Размещение образцов в крио-защитным, таких как бактерии, что уменьшает распространение ледяные кристаллы, может уменьшить этот ущерб. Тем не менее,надо еще скрининг образцов с помощью электронного микроскопа и отбросить те, с замораживанием артефактов. Во-вторых, GMA не пересекают-ссылка на тканях, как эпоксидные смолы, и, таким образом образцы часто отрываются от окружающего пластика и растяжения, сжатия или даже выпасть из раздела (рис. 3 и D). Препарирование образца от бактерий или других крио-защитным перед вложением обеспечивает большее сцепление пластиковых образцов (рис. 3). Кроме того, такие структуры, как липидных капель в кишечнике часто диссоциируют из тканей в связи с отсутствием сшивки (Рис. 3E). В-третьих, неполная полимеризация пластиковых причин растяжение или складывания ткани (рис. 3F); присутствие кислорода в образце также препятствует полимеризации GMA. В-четвертых, бедные секционирования качества GMA часто приводит к противоречивой морфологии (рис. 3G и H). GMA разделы должны быть обрезаны при70 нм или более толстые и со скоростью около 1,6 мм / сек для минимизации артефактов секционирования. В-пятых, фон автофлуоресценции от пыли на покровное или раздел неизбежна. Аутофлуоресцентной от пыли можно свести к минимуму с помощью предварительно очищены покровные и избегая попадания пыли от Kimwipes и фильтровальную бумагу, как описано в протоколе. Программа PALM анализа можно отредактировать сигналов от образца или пластика, который флуоресцирует дольше, чем обычные сигналы от флуоресцентных белков (рис. 2, Б). Окончательное изображение, следовательно, быть свободным от таких артефактов. Рисунок 1. Выравнивание флуоресценции и электронного микроскопа с использованием золотых наночастиц. (A) низкой электронной микрофотографии с увеличением сечения C. Элеганс выражения отмеченных гистонов ТДУС :: HIS-11. Белыйrrows указывают на 100 нм, электронно-плотные наночастицы золота применяются до PALM изображений, которые служат в качестве точек отсчета. (B) золотых бусин светиться при воздействии на ~ 580 нм, свет и создают точек отсчета в флуоресценции изображение. Изображение сумму TIRF выравнивается на электронной микрофотографии на основе местоположения меток. Изображение сумму TIRF представляет все фотоны определенных камерой в ходе экспериментального учебного времени. Обратите внимание, что яркие пятна в левом верхнем углу (белая стрелка) возникают в результате скопления частиц золота. (C) PALM изображение будет добавлено в электронном микроскопе и поворачивают и переведена на основе значений определяется из выравнивание изображения в сумме TIRF (B). Нажмите, чтобы увеличить показатель . <bг /> Рисунок 2. Корреляционный нано-FEM использованием гибридных белков гистонов. (A) Сумма TIRF образ ТДУС :: HIS-11, приобретенные у тонкой части (70-нм). (B) соответствующее изображение ладони ТДУС :: HIS-11. Аутофлуоресцентной (белая стрелка) длится дольше, чем 500 мс были отфильтрованы PALM программы. (C) Электронная микрофотография ядра, приобретенные у того же раздела. (D) корреляционно изображение ладони и электронного микроскопа ТДУС :: HIS-11. Флуоресценция плотно локализованные в хроматина в ядре. Рисунок 3. Проблемы, связанные с нано конечных элементов. (A) Электронные микрофотографии C. Элеганс мышц тела без повреждения льдом кристалла. (B) Электронная микрофотография мышц тела со льдом повреждения кристалла. Вместо дискретных сечений, актина и миозина, сворачиваются в агрегаты за счет образования кристаллов льда. (C, D) Низкое увеличение электронного микроскопаы, показывающие диссоциации червей из окружающей среды. В разделе более искаженный в образце, который окружен крио-защитных бактерий (D), чем когда образец находится в окружении пластиковых (C). Бактериальных крио-защитным В gallette должны быть отсечен от фиксированного образца до пластиковых вложения. Обратите внимание, что животное справа в (D) был разрез наискосок, и, таким образом форма не связана с искажением тканей. (E) Электронная микрофотография кишечника, показывая, уволенных из ткани (черные стрелки). (F) Электронные микрофотографии нервное кольцо, показывая, складывающиеся из разделов из-за неполной полимеризации пластиковая (черная стрелка). (G, H) Электронные микрофотографии нейронов из того же образца, подразделяются на разные даты. Сохранение ткани превосходно на один день (G), но такие морфологии затемняется несовместимых качества срезов (H). Нажмите здесь, чтобы VМЭН большие фигуры.