ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

1. הקפאה בלחץ גבוה הכן cryo-protectant ידי הוספת 0.2 גרם של BSA לתוך 1 מ"ל של מדיום מתאים לדגימה שלך (לדוגמה, תרבות בינונית לתרביות תאים, M9 לאלגנס). דגירת הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שכל BSA נמס. לפני ההקפאה, למלא את המכשיר בהקפאת החלפה האוטומטי (ליקה AFS) עם חנקן נוזלי הגדר את תכנית AFS: -90 מעלות צלזיוס במשך * שעות 5-30, 5 ° C / שעה ל-60 ° C, -60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות (או לבחור באפשרות "להשהות" אם אתה משתמש Leica AFS 2), 5 ° C / שעה ל-30 ° C ו -30 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. אם מכשיר AFS מסוגל לבלות יותר מחמישה צעדים, צעד -30 ° C צריך להיות מוחלף עם אפשרות "להשהות" מוגדרת 0 שעות, ויש להוסיף שני צעדים נוספים: 10 מעלות צלזיוס / שעה ל-20 ° C ו 24 שעות ב -20 ° C. אם המכשיר מוגבל לחמישה שלבים, להגדיר תכנית אחרת בחריץ אחר כדלקמן: 10 ° C / השעה ל -20 מעלות צלזיוס ו24 שעותr ב -20 ° C. * הזמן כאן יכול להיות מותאם כך ש-60 ° C הצעד מתחיל בשעתי הבוקר המוקדם. הכן 1% פתרון מניית tetroxide אוסמיום ידי ערבוב 0.1 גבישי tetroxide אוסמיום g ​​(EMS, RT19134) עם 10 מ"ל של אצטון נטול מים (EMS, # RT10016). הכן את fixatives בצינור חרוטים 50 מ"ל כדלקמן. ראשית, להוסיף 1 מ"ל של מי milliQ, ולאחר מכן לפזר אותו ב0.02 גרם של פרמנגנט האשלגן (EMS, RT20200). הוסף 19 מ"ל של אצטון ולערבב אותו היטב. לבסוף, להוסיף 20 μl של 1% פתרון מניית אוסמיום לתוך הצינור. אצטון הוא נבלות רדיקלים חופשיים 11 ובכך מונע פילמור של פלסטיק, אך השימוש באצטון כמדיום הקפאת תחלופה נחוץ לשמירה על מורפולוגיה בשל האינטראקציה שלה עם שומנים. אצטון יוחלף עם אתנול לפני חדירת פלסטיק. מיליליטר aliquot 1 לכל cryovial ולשמור על fixatives קפוא ידי אחסון הצינורות בחנקן נוזלי. מלא מנשא דגימה עם BSA 20% או חיידקים.שניהם BSA וחיידקים 20% לשמש Cryo-protectants. הבחירה לסוג של מוביל הדגימה תלויה בדגימה. לג elegans, להשתמש ב100 מיקרומטר היטב. הנח את הדגימה במנשא ולהקפיא אותו באמצעות הקפאה בלחץ גבוה. לאחר הקפאה ותחת חנקן נוזלי, להעביר את הדגימה לcryotube מכיל fixatives. ודא את הדגימה נשארת תחת הנוזל בכל העת. חזור על 1.5) – 1.7) עד שכל הדגימות מוקפאות. להעביר את כל cryotubes ליחידת AFS, ולחדש את התכנית. 2. הקפאת החלפה כאשר הטמפרטורה מגיעה ל -60 מעלות צלזיוס, בקבוקונים המכילים 20 מיליליטר מקום של אצטון 95% לAFS. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל -50 מעלות צלזיוס, החליפו את fixatives עם אצטון 95% שש פעמים במשך התקופה של 2 שעות. הנח בקבוקון המכיל 20 מ"ל של 0.1% יצטט uranyl (Polysciences, # 21447-25) באצטון 95% לקנה ומראש זה מגניב ל-50 ° C. בתום שלב השטיפה, להוסיף ~ 1 מ"ל של תמיסה יצטט uranyl לכל בקבוקון. בטל שהייה של התכנית במידת צורך. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל -30 מעלות צלזיוס, החליפו תצטט uranyl עם אתנול 95% שש פעמים במשך התקופה של 2 שעות. בינתיים, עושה עלייה של 97% שרף methacrylate גליקול (GMA, ספקי SPI / בדיקת מבנה, Inc, # 02630-AA) ע"י ערבוב 22.3 המ"ל GMA, Methacrylate 10ml n-בוטיל, מי 1 מ"ל milliQ, ומי חמצן 0.2 גרם בנזואיל (זרז). לאחסן אותו בבקבוקוני זכוכית (EMS, # 72632) ולהכין 30% GMA ידי לערבב אותו עם אתנול 95%. אין לאחסן מדיה GMA בצינורות פלסטיק בגלל האיכות של פילמור מדרדרת עם האחסון לטווח ארוך בפלסטיק פוליאתילן מבוסס. טרום מגניב פתרון GMA ל -30 ° C. שרף אפוקסי מסורתי כגון Araldite וEPON לא ניתן להשתמש בפרוטוקול מכיוון שהם נטולי מים והחומץ שמרווה חלבוני ניאון. רפי אקריליים, כגון LR הלבן, גלסבול כמות קטנה של מים ויכול לשמר את חלבון פלואורסצנטי, אבל חומצי pH שלה נוטה להרוות fluorophore 12. GMA סובל, למעשה דורש, כמות קטנה של מים והוא בסיסי (pH8) 12. GMA למרבה הצער מעט פריך. יתר על כן, לא GMA-קישור צולב עם רקמות כמו שרף אפוקסי מסורתי לעשות. תכונות אלו של חוסר עקביות סיבת GMA בחתך איכות במיוחד כאשר נותחו יותר רזה 80 ננומטר. למרות שחיי המדף של GMA הוא כשנה, GMA יש להשתמש תוך 3 חודשים מהרכישה על מנת להבטיח את איכותו. 3. הסתננות ופלמור צעדים 3.1-3.3 מבוצעים באותם cryovials משמש להקפאת החלפה. ההסתננות ופילמור מתבצעים ב-30 מעלות צלזיוס בAFS לשמר חלבון פלואורסצנטי. הכן תקשורת חדירה על ידי ערבוב של פתרון מניות GMA עם אתנול 95%. דגירת דגימותב30% GMA במשך 3-5 שעות. דגירת דגימות ב70% GMA עבור 4-6 שעות. דגירת דגימות ב97% GMA בן הלילה. ביום המחרת, איפור טרי 97% GMA. להעביר את הדגימות לעובש הטבעה (EBSciences, # TC). הכן את דיסק של סרט ACLAR (EMS, # 50425-10) באמצעות 3/8 "הדיסק Punch (טד פלה Inc) והנח את הדיסק בתחתית הקפסולה Beem. בורסה 97% GMA פי שלוש מעל 6 שעות ב-30 ° C. לאחר החילופים השלישיים, להוסיף היוזם N, N-דימתיל-p-toluidine (סיגמה אולדריץ, # D9912) לGMA בריכוז של 1.5 μl / המ"ל GMA 1 ולהחיל את הפתרון הזה לכל תבנית דגימה. מייד למקם את הדגימה בעובש ההטבעה בAFS. שים לב שנזואיל פרוקסיד הוא זרז ונוכחת בכל שלבי החדירה ולכן הערבוב לא הכרחי. נזואיל פרוקסיד אינו פלמר הפלסטיק עד שהוא נחשף ליוזם הכימי N, N,-דימתיל-p-toluidine. היוזם מפעיל polymerization באופן מיידי ופלמר השרף אפילו ברקמות בתוך השעה 1. עם זאת, נושרי רקמות עלולים לגרום לרקמות עמוקות עקב פילמור השלם. יתר על כן, GMA אינו Crosslink הדגימה כדי לחסום היטב, כך להפריד את הדגימה מcryoprotectant על ידי קשה על המטריצה ​​של חיידקים. אם פילמור מתבצע מחוץ לAFS, עובש ההטבעה חייב להיות מכוסה בדיסק aclar לחסום חשיפה לחמצן. GMA אינו פלמר לחלוטין כאשר נחשפו לחמצן. אפשר הפלסטיק לרפא לילה למרות שזה polymerizes בתוך השעה 1. אחסן את הדגימה בשקית מלאה בגז חנקן ואקום (רוכסן) במקפיא (-20 מעלות צלזיוס) עד עיבוד נוסף, כך שחלבוני ניאון אינם חשופים לחמצן. 4. קטגוריות קיימות חתך של דגימות GMA-משובצת יכול להתבצע באופן דומה לזה של דגימות EPON-משובצת. זהירות צריכה להיות לקחתn לא להרטיב את פני שטח החתך בגלל GMA הוא מאוד הידרופילי והסרטים יהיו מונעים לתוך אמבט המים אם הם הורטבו בשני הצדדים. איסוף סרטי סעיפים 50-80 (ננומטר) על coverslip זכוכית אם מיקרוסקופ TIRF משמש ללוקליזציה. אחרת, להשתמש ברשת גרמה למיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים. מהירויות חיתוך צריכות להיות מוגדרות at1.6 מ"מ / s או גבוה יותר. אחרת, סרט לא יכול להיוצר. אם לא אגפי החנות ב -20 ° C צלם באופן מיידי. להגן על fluorophores מאור UV על ידי כיסוי מחזיקי סעיף ברדיד אלומיניום. 5. PALM הדמיה הגדרת מיקרוסקופ PALM פי המלצות יצרן. הטמפרטורה של מצלמת EMCCD צריכה להיות מוגדרת -70 מעלות צלזיוס או מתחת. החל חלקיקי זהב (# 790122-010 – 2x המרוכז, microspheres-nanospheres.com) בתמיסה (כ 50 μl) למדגם להיות צלם. אפשר הפתרון לשבת במשך 30 שניות על העטיפותשפה תוך תחת מקרה כיסוי שחור. הסר את פתרון הזהב על ידי פיצוצו לקצה coverslip וספג אותו עם kimwipe. הכנס את coverslip לבעל coverslip מעגלי. במידת צורך, למרוח משחת ואקום לשולים לשמור coverslip במקום. החל שמן טבילה לחלק התחתון של coverslip, ישירות מתחת לדגימות. הכנס את בעל המדגם לחריץ על הבמה של מיקרוסקופ. קח טיפול מיוחד שלא לגעת ביעדים. כוון את המחזיק כך שהוא חזק ומרכזי הסעיפים לעיל האובייקטיבי. לאתר את החלקים באמצעות עדשה אובייקטיבית 10x. שינוי למטרת עדשת 100x. התמקד בדגימה. אתר אזור של עניין על ידי התבוננות על החוזק של אותות הקרינה. השתמש בליזר ננומטר 488 ולהגביר את האינטנסיביות בתפריט הערוצים עד 10%. התמקד באזורים של קרינה הבהירה ביותר. שים לב שצעד זה אינו נחוץ אם אזור oעניין F ניתן לזהות בשדה הבהיר על ידי עין. מעבר לליזר 561 ננומטר ולהגביר את האינטנסיביות עד 100% כדי להלבין את autofluorescence הרקע. אקונומיקה לדוגמה עבור ~ 2 דקות. אם שינויי המיקוד במהלך ההלבנה, לאפשר 5 דקות לחלוף לפני התאמתי את הפוקוס ולכידת תמונות. זה מאפשר להשהות את הטמפרטורה עד שתתייצב. אם היקף PALM מצויד בתא דגירה, לקבוע את הטמפרטורה עד 20 מעלות צלזיוס, ולחכות ל~ 2 שעות כדי לייצב את הטמפרטורה בחדר. כשההלבנה תושלם, להפעיל את ליזר ננומטר 405 ולהגדיר אותו לעצמה הנמוכה ביותר. להתחיל לאסוף את התמונות ב 20 פריימים לשניים. אנחנו בדרך כלל לאסוף 5,000-6,000 מסגרות לניסוי, אך מספר הפריימים צריך להיות מותאם בהתאם למטרת הניסוי. לדוגמה, אם כל החלבונים באזור של עניין חייב להיות צלם, מספר המסגרת צריך להיות מוגבר. אם האותות הם דלילים או חלשים, לאט increase 405 עוצמת ליזר ננומטר. במהלך תהליך הרכישה, הקפד לשמור את הדגימות בפוקוס על ידי התאמה בזהירות את הכפתור בהתאם לצורך. כאשר תמונות שנאספו, ניתוח PALM צריך להתבצע. לtdEos, אנו מסננים כל אותות כי לזרוח יותר מ 500 אלפיות שני משום שהאותות הללו הם כנראה עקב autofluorescence. 6. SEM הדמיה לפני הדמית SEM, להכתים את החלקים באמצעות 2.5% יצטטו uranyl (במים) במשך 4 דקות. לשטוף יצטט uranyl ביסודיות עם מי milliQ מסוננים. לאחר שהקטעים שהתייבשו, פחמן מעייל coverslip באמצעות פחם רוקק עד coverslip הופך חשוך למדי. החל קצה אחד של קלטת מוליך פחם בקצה coverslip ואת הקצה השני על בדל המתכת, כך שאלקטרונים שמצטברים על פני השטח של coverslip מעוגנים. הר את הדגימה לSEM הקאמרי (פיי נובה Nano). הכנס את גלאי VCD. </li> סגור את החדר ולשאוב אותו באמצעות הגדרת הוואקום הגבוהה. ברגע שפונה, פתח את שסתום העמודה כך שאלומת האלקטרונים מוחלת על דגימה. לבצע יישור שגרתי של אלומת אלקטרונים. אתר את הדגימה. ברגע שהמוקד מותאם, לקשר את שלב הדגימה ולהביא את הבמה עד 5 מ"מ מתחת לחתיכת המוט. קח תמונת הגדלה נמוכה של הדגימה (~ 5000 x). התקרב לאזור של העניין ולקבל הגדלה גבוהה (50,000 x) תמונות. לעבור לסעיף הבא, וחזור על שלב 6.10) ו6.11) עד שכל החלקים הם צלמו. 7. יישור תמונות PALM ו EM פתח פוטושופ ואת תמונות SEM הנרכשים. יצירת חלון חדש עם מידות 5000 5000 פיקסלים ו 300 פיקסלים / רזולוצית אינץ. העתק את תמונת SEM הגדלה הנמוכה לחלון החדש (איור 1 א). התאם את התמונה כך שהיא ממלאת אתכל החלון באמצעות מניפולצית המרה (Command + T עבור מק). העתק את ההגדלה הגבוהה SEM תמונות ומקטין אותם במידת צורך. להעיף את תמונת TIRF הסכום אופקי על ידי בחירת סיבוב תמונה משורת התפריטים נפתחת התמונה. העתק והדבק את תמונת סכום TIRF (מPALM) לתוך שכבה חדשה. התאם את התמונה באמצעות מניפולצית המרה ולאחר מכן סובב צורך, כדי להתאים את הקרינה של חלקיקי הזהב (חצים לבנים באיור 1 א ') עם המבנים המתאימים דמיינו בSEM (1B איור). העתק את תמונת PALM לתוך שכבה חדשה וליישם את אותו השינוי (האיור 1C). תמונה גבוהה יותר גדלה ניתן לחלץ מתמונה זו (איור 2). למצגת, להעתיק את תמונת PALM הופך לשכבה חדשה. בחר את אותות פאלם אבל לא ברקע באמצעות "טווח צבעים" בתפריט הנפתח "בחר". הקפד selECT פיקסל כרקע פיקסל התייחסות ולהפעיל את האפשרות "להפוך". חותך את אותות PALM הרצויים ולהדביק אותם לשכבה חדשה. החל שקיפות לשכבת הרקע, ולהגדיר אותו עד 10%. זה מאפשר להדמיה של אותות PALM על ידי ביצוע הרקע שקוף מבלי להתפשר על העצמה שלהם (האיור 2D). 8. נציג תוצאות היסטון תויג tdEos יכול לבוא לידי ביטוי ביציבות בנמטודות ג elegans, ובעלי החיים המהונדסים עובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל. את micrographs PALM והאלקטרון נרכשו מאותו הסעיף (איור 1). כדי ליישר את התמונות, את תמונת סכום TIRF, המסכמת את הקרינה במשך הזמן כולו, היא מעולפת על מיקרוסקופ האלקטרונים. חלקיקי הזהב מופיעים בשני micrographs הקרינה ואלקטרונים, וניתן להשתמש כדי ליישר את שתי תמונות באמצעות 'transfהפונקציה 'ORM בפוטושופ (איור 1 א' וב '). ואז, באותו הערך 'המרה' היה מוחל על תמונת PALM (התרשים 1C). בהגדלה זו, פירוט מבני לא ניתן להבדיל, כך שטסנו לאזור בסמוך לקצה העליון של מיקרוסקופ (איור 2). בתמונה בהגדלה הגבוהה, פרטי subcellular כגון גרעין, נקבוביים הגרעינון, גרעיני, וreticulum endoplasmic יכולים להיבחן. יתר על כן, את מולקולות היסטון המתויגים המותאמים לשפה מקומיות באופן בלעדי לגרעין, אבל לא לגרעינון, כצפוי. PALM ואלקטרון מיקרוסקופיה הגומלת וכך מאפשרת ללוקליזציה חלבון ברזולוציה הגבוהה ביותר. חמש בעיות יכולות להתפשר על האיכות של תמונות. ראשית, ניזק גביש קרח יכול לעוות ultrastructure (האיור 3A ו-B). להעביר דוגמאות בחיידקי cryo-protectant כגון, אשר מפחית את ההתפשטות של גבישי קרח, יכול להפחית את הניזק הזה. עם זאת,אחד עדיין חייבת להקרין דגימות על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים ולהשליך חפצים אלו עם הקפאה. שנית, GMA אינו חוצה-קישור לרקמות כמו שרף אפוקסי, ולכן לעתים קרובות דגימות להשתחרר מהפלסטיק ולמתוח שמסביב, להתכווץ או אפילו נפולת של הסעיף (האיור 3C ו-D). נתיחה של המדגם הרחק מהחיידקים או האחרים cryo-protectant לפני ההטבעה מספקת להידבקות גדולה יותר של הפלסטיק לדגימה (האיור 3C). כמו כן, מבנים כגון טיפי שומנים במעיים לעתים קרובות מתנתקים מהרקמות עקב העדר cross-linking (איור 3E). שלישית, פילמור השלם של סיבות פלסטיק מתיחה או קיפול של רקמות (איור 3F); נוכחות החמצן במדגם גם מפריע לפילמור של GMA. רביעי, איכות הירודה של חתך GMA לעתים קרובות תוצאות מורפולוגיה עקבית (האיור 3G ו-H). סעיפי GMA צריכים לחתוך ב70 ננומטר או עבה יותר ובמהירות של כ 1.6 מ"מ / s כדי למזער חתך חפצים. החמישי, autofluorescence רקע מאבק על coverslip או הסעיף היא בלתי נמנע. Autofluorescence מאבק ניתן למזער באמצעות coverslips מראש לניקוי ועל ידי הימנעות מזיהום אבק מkimwipes ונייר מסנן כמתואר בפרוטוקול. תכנית ניתוח PALM יכולה לערוך את האותות מהדגימה או הפלסטיק שלזרוח יותר מאותות טיפוסיים מחלבוני ניאון (איור 2 ו-B). התמונה הסופית תהיה אפוא חופשיה של חפצים מסוג זה. איור 1. יישור micrographs קרינה ואלקטרונים באמצעות חלקיקי זהב. () מיקרוסקופ אלקטרוני הגדלה נמוך מחתך של ג elegans מבטא את tdEos היסטון המתויג ::-11 שלו. לבןrrows מציין 100 ננומטר זהב אלקטרונים צפופי חלקיקים שיושמו עד להדמית PALM שמשמש גם כסימני fiducial. (ב) בחרוזי הזהב לזרוח בחשיפה לאור ~ 580 ננומטר וליצור סימני fiducial בתמונת פלואורסצנטי. תמונת TIRF הסכום מיושרת אל מיקרוסקופ אלקטרונים המבוסס על מיקומו של סימני fiducial. תמונת TIRF הסכום מייצגת את כל הפוטונים זוהו על ידי המצלמה במהלך זמן הניסוי. שים לב שנקודתי האור בחלק השמאלי העליון (חץ לבן) נובעות מהאשכולות של חלקיקי זהב. (ג) תמונת PALM היא אז הוסיף למיקרוסקופ אלקטרונים והמסובבים ומתורגם בהתבסס על הערכים שנקבעו מהיישור של תמונת TIRF הסכום ב( B). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <br /> איור 2. () מתאם ננו Fem באמצעות היתוך חלבוני היסטון. תמונת סכום של TIRF tdEos ::-11 שלו שנרכשו מסעיף דק (70nm). (ב) תמונה מקבילה כף tdEos ::-11 שלו. Autofluorescence (חץ לבן) נמשכים יותר מ 500 אלפיות היו סונן על ידי תכנית PALM. (ג) מיקרוסקופ אלקטרונים של גרעין שנרכש מאותו הסעיף. (ד) תמונה המצטרפת PALM ומיקרוסקופ אלקטרונים של tdEos ::-11 שלו. פלואורסצנטי מותאם היטב לכרומטין בגרעין. איור 3. בעיות הקשורות לננו פאם. () מיקרוסקופ אלקטרונים של ג שרירי גוף elegans ללא ניזק גביש קרח. (ב) מיקרוסקופ אלקטרונים של שריר גוף עם ניזק גביש קרח. במקום חתכים בדידים, סיבי שרירן יקטין והתמוטטו לתוך אגרגטים בשל ההיווצרות של גבישי קרח. הגדלה נמוך (C, D) האלקטרון מיקרוסקופזה, מראה את הניתוק של תולעים מהתקשורת שמסביב. הסעיף הוא יותר מעוות בדגימה שהוא מוקף על ידי החיידקים המגנים cryo-(ד) מאשר כאשר הדגימה היא מוקפת בפלסטיק (C). Cryo-protectant חיידקים בgallette צריך להיות גזור ממדגם הקבוע לפני הטבעת פלסטיק. שים לב שהחיה בצד ימין ב( ד ') נותחה באלכסון, ולכן הצורה לא בשל העיוות של רקמות. (ה) מיקרוסקופ אלקטרונים של מעי, מראה נושרים של רקמות (חיצים שחורים). (F) מיקרוסקופ אלקטרונים של טבעת עצב, מראה מתקפל של סעיפים עקב פילמור השלם מפלסטיק (חצים שחורים). (G, H) micrographs האלקטרונים של נוירונים מן הדגימה, מחולק בתאריכים שונים. שימור הרקמות הוא מעולה ביום אחד (G), אבל מורפולוגיה כגון מוסתרת על ידי איכות החתך העקבית (H). לחץ כאן לvדמות גדולה iew.