Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Ein. Hochdruck-Freezing Bereiten Sie die Cryo-Schutzmittel durch Zugabe von 0,2 g BSA in 1 ml eines geeigneten Medium für Ihre Probe (zum Beispiel Kulturmedium für Zellkulturen, M9 für C. elegans). Das Röhrchen in ein 37 ° C Wasserbad, bis alle BSA gelöst ist. Vor dem Einfrieren, füllen Sie die automatisierte freeze-Substitution Gerät (Leica AFS) mit flüssigem Stickstoff Stellen Sie die AFS-Programm: -90 ° C für 5-30 h *, 5 ° C / h bis -60 ° C, -60 ° C für 2 Stunden (oder wählen Sie "Pause"-Option, wenn Sie Leica AFS 2 sind), 5 ° C / h auf -30 ° C und -30 ° C für 72 Stunden. Wenn die AFS-Maschine ist in der Lage, mehr als fünf Schritte, sollte die -30 ° C Schritt mit einer "Pause"-Option auf 0 gesetzt hr ersetzt werden, und zwei weitere Schritte hinzugefügt werden soll: 10 ° C / h bis -20 ° C und 24 Stunden bei -20 ° C. Wenn die Maschine fünf Schritte beschränkt ist, einzurichten anderes Programm in einem anderen Speicher-Slot wie folgt: 10 ° C / h bis -20 ° C und 24 hr bei -20 ° C. * Es kann dabei so eingestellt, dass der Schritt -60 ° C in den frühen Morgenstunden beginnt. Planen 1% Osmiumtetroxid Stammlösung durch Mischen von 0,1 g Osmiumtetroxid Kristalle (EMS, RT19134) mit 10 ml wasserfreiem Azeton (EMS, # RT10016). Bereiten Sie die Fixiermittel in einem 50 ml konischen Röhrchen wie folgt. Zuerst fügen 1 ml Milli-Q Wasser, und dann lösen sich in sie 0,02 g Kaliumpermanganat (EMS, RT20200). Fügen Sie 19 ml Aceton und gut mischen. Schließlich, fügen Sie 20 ul 1% Osmium Stammlösung in die Röhre. Aceton ist ein Radikalfänger 11 und verhindert somit Polymerisation von Kunststoff, aber die Verwendung von Aceton als gefriergetrocknete Substitutionsmediums ist notwendig für den Erhalt Morphologie aufgrund seiner Wechselwirkung mit Lipiden. Aceton wird mit Ethanol vor plastische Infiltration ersetzt werden. Aliquote von 1 ml zu jeder Kryoröhrchen und halten die Fixiermittel durch Speichern der Röhrchen in flüssigem Stickstoff eingefroren. Füllen Sie einen Probenträger mit 20% BSA oder Bakterien.Sowohl 20% BSA und Bakterien dienen als Kryo-Schutzmittel. Die Wahl für den Typ des Probenträgers hängt von der Probe. Für C. elegans, verwenden Sie ein 100 um gut. Legen Sie die Probe in den Träger und frieren Sie sie mit einem Hochdruck-Gefrierschrank. Nach dem Einfrieren und unter flüssigem Stickstoff, übertragen Sie die Probe in die Kryoröhrchen mit Fixative. Sicherstellen, dass die Probe bleibt unter der Flüssigkeit zu allen Zeiten. Wiederholen 1,5) – 1,7), bis alle Proben eingefroren werden. Übertragen Sie alle Kryoröhrchen in den AFS-Einheit, und setzen Sie das Programm. 2. Freeze-Substitution Wenn die Temperatur -60 ° C erreicht, statt Fläschchen mit 20 ml 95% Aceton in der AFS. Wenn die Temperatur -50 ° C erreicht, ersetzen die Fixative mit 95% Aceton sechsmal im Zeitraum von 2 Stunden. Legen Sie ein Fläschchen mit 20 ml 0,1% Uranylacetat (Polysciences, # 21447-25) in 95% Aceton in die Kammer undVorkühlung es bis -50 ° C. Am Ende des Waschschritts, fügen ~ 1 ml Uranylacetat Lösung in jede Phiole. Unpause das Programm, wenn notwendig. Wenn die Temperatur -30 ° C erreicht, ersetzen Sie die Uranylacetat mit 95% Ethanol sechsmal über den Zeitraum von 2 Stunden. In der Zwischenzeit, Make-up 97% Glykol Methacrylatharz (GMA, SPI Supplies / Structure Probe, Inc., # 02630-AA) durch Mischen 22,3 ml GMA, 10ml n-Butylmethacrylat, 1 ml milliQ Wasser und 0,2 g Benzoylperoxid (Katalysator). Bewahren Sie es in Glasfläschchen (EMS, # 72632) und bereiten 30% GMA, indem es mit 95% Ethanol. Bewahren Sie keine GMA Medien in Kunststoffrohren, weil die Qualität der Polymerisation nimmt mit der langfristigen Lagerung in Polyethylen-basierte Kunststoffe. Pre-kühlen die GMA-Lösung bis -30 ° C. Traditionelle Epoxidharze wie Araldit und Epon kann nicht in dem Protokoll verwendet werden, da sie wasserfreien und sauren welche quencht fluoreszierende Proteine ​​sind. Acrylharze, wie zB LR White, cein tolerieren eine geringe Menge an Wasser auf und kann das fluoreszierende Protein zu erhalten, sondern ihre sauren pH neigt dazu, den Fluorophor 12 quenchen. GMA toleriert in der Tat erfordert, eine kleine Menge Wasser und ist alkalisch (pH 8) 12. GMA ist leider etwas spröde. Darüber hinaus macht GMA nicht Cross-Link mit Geweben wie herkömmliche Epoxidharze haben. Diese Eigenschaften der GMA Ursache Inkonsistenz in Schneiden Qualität, vor allem, wenn im Schnitt dünner als 80 nm. Obwohl die Haltbarkeit von GMA ist etwa ein Jahr, sollte GMA innerhalb von 3 Monaten nach dem Kauf verwendet werden, um ihre Qualität zu gewährleisten. 3. Infiltration und Polymerisation 3,1-3,3 Schritte sind in den gleichen Kryovials für Gefriersubstitution verwendet durchgeführt. Infiltration und Polymerisation werden bei -30 ° C in der AFS, um das fluoreszierende Protein erhalten durchgeführt. Planen Infiltration Medien durch Mischen des GMA-Stammlösung mit 95% Ethanol. Inkubieren Probenin 30% GMA für 3-5 Stunden. Inkubieren Proben in 70% GMA für 4-6 Std. Inkubieren Proben in 97% GMA Nacht. Am nächsten Tag, Make-up frische 97% GMA. Übertragen Sie die Proben zu einer Einbettform (EBSciences, # TC). Bereiten Sie eine Scheibe des ACLAR Film (EMS, # 50425-10) mit einem 3/8 "DISC Punch (Ted Pella Inc.) und legen Sie die Diskette in der Unterseite des BEEM Kapsel. Tauschen Sie die 97% GMA dreimal über 6 Stunden bei -30 ° C. Nach der dritten Vermittlungsstelle, füge den Initiator N, N-Dimethyl-p-toluidin (Sigma-Aldrich, # D9912), um GMA bei einer Konzentration von 1,5 ul / 1 ml GMA und Anwenden dieser Lösung auf jede Probe Form. Unmittelbar positionieren die Probe in der Einbettform in der AFS. Beachten Sie, dass Benzoylperoxid der Katalysator ist und bei allen Infiltration Schritte vorhanden, so Rühren nicht notwendig ist. Benzoylperoxid nicht polymerisiert den Kunststoff bis es zu dem chemischen Initiator N, N,-Dimethyl-p-toluidin ausgesetzt ist. Der Initiator aktiviert polymerization sofort und wird das Harz auch in Geweben innerhalb 1 h polymerisieren. Dennoch kann das Gewebe Aussetzer in tiefe Gewebe aufgrund der unvollständigen Polymerisation führen. Darüber hinaus hat GMA nicht vernetzen die Probe auf den Block gut, so trennen die Probe aus dem Gefrierschutzmittel, indem Sie auf der Matrix von Bakterien. Wird die Polymerisation außerhalb eines AFS durchgeführt wird, muss die Form mit einer Einbettung Aclar Platte auf Einwirkung von Sauerstoff blockieren abgedeckt werden. GMA nicht vollständig zu polymerisieren, wenn sie Sauerstoff ausgesetzt sind. Lassen Sie den Kunststoff über Nacht zu heilen, obwohl es innerhalb von 1 Stunde polymerisiert. Speichern die Probe in einem Stickstoffgas gefüllt Vakuumbeutel (Ziploc) im Gefrierschrank (-20 ° C) bis zur weiteren Verarbeitung, so dass fluoreszierende Proteine ​​nicht zu Sauerstoff ausgesetzt sind. 4. Schnitte Schneiden von GMA eingebettete Proben können in einer Weise ähnlich der für Epon eingebettete Proben durchgeführt werden. Besondere Vorsicht sollte nehmenn nicht zu benetzen die Oberfläche wegen sectioning GMA ist sehr hydrophil und die Bänder werden in das Wasserbad angetrieben werden, wenn sie beidseitig benetzt werden. Collect Bänder aus Abschnitten (50-80 nm) auf einem Deckglas wenn ein TIRF Mikroskop für die Lokalisierung verwendet wird. Andernfalls verwenden Sie ein Raster für die Transmissionselektronenmikroskopie gemacht. Die Schnittgeschwindigkeit sollte at1.6 mm / s oder höher eingestellt werden. Andernfalls kann ein Band nicht zu bilden. Shop Abschnitten bei -20 ° C, wenn nicht abgebildet sofort. Schützen Sie die Fluorophore von UV-Licht durch Abdecken Abschnitt Halter mit Aluminiumfolie. 5. PALM Imaging Richten Sie den PALM Mikroskop nach den Empfehlungen des Herstellers. Die Temperatur eines EMCCD Kamera sollte bis -70 ° C oder darunter eingestellt werden. Anwenden Goldpartikel (# 790.122-010 – 2x konzentrierten, Mikrosphären-nanospheres.com) in Lösung (etwa 50 ml) auf die Probe abgebildet werden soll. Lassen Sie die Lösung für 30 Sekunden auf den Abdeckungen sitzenLippe, während unter einer schwarzen Abdeckung Fall. Entfernen Sie die Goldlösung durch Ausblasen zum Rand des Deckglases und es mit einem absorbierenden Kimwipe. Legen Sie das Deckglas in einen kreisförmigen Deckglas Halter. Falls erforderlich, ein Vakuum Fett auf der Felge das Deckglas in Position zu halten. Immersionsöl gelten an der Unterseite des Deckplättchens, direkt unterhalb der Proben. Legen Sie den Probenhalter in den Schlitz auf der Bühne des Mikroskops. Achten Sie besonders darauf, um die Ziele zu berühren. Passen Sie die Halterung so dicht ist und zentriert die Abschnitte über dem Ziel. Suchen Sie in den Abschnitten mit einem 10x-Objektiv. Wechseln Sie in dem 100x Objektiv. Konzentrieren Sie sich auf die Probe. Lokalisieren eines Bereichs von Interesse durch die Beobachtung der Stärke der Fluoreszenz-Signale. Verwenden Sie die 488-nm-Laser und steigern die Intensität in der Kanäle-Menü zu 10%. Konzentrieren Sie sich auf den Gebieten der hellsten Fluoreszenz. Beachten Sie, dass dieser Schritt nicht erforderlich ist, wenn der Bereich of Interesse kann im Hellfeld mit bloßem Auge erkannt werden. Schalten Sie den Laser um 561 nm und erhöhen die Intensität auf 100% zu bleichen aus dem Hintergrund-Autofluoreszenz. Bleach die Probe für ca. 2 min. Wenn der Fokus beim Bleichen, erlauben 5 min abgewartet werden, bevor das Einstellen des Fokus und der Aufnahme von Bildern. Diese Pause kann die Temperatur zu stabilisieren. Wenn der PALM Umfang mit einer Inkubationszeit Kammer ausgestattet ist, stellen Sie die Temperatur auf 20 ° C und warten Sie für ca. 2 Stunden, um die Temperaturen in der Kammer zu stabilisieren. Beim Bleichen abgeschlossen ist, aktivieren Sie die 405-nm-Laser und setzen Sie ihn auf die niedrigste Intensität. Sammeln Sie die Bilder bei 20 Bildern pro Sekunde. Wir in der Regel sammeln 5000-6000 Frames pro Experiment, aber die Anzahl der Frames sollte so eingestellt werden je nach Ziel des Experiments werden. Zum Beispiel, wenn alle Proteine ​​in einer Region von Interesse muß abgebildet werden, sollte die Rahmennummer erhöht werden. Wenn die Signale spärlich oder schwach sind, langsam Increase der 405 nm Laser-Intensität. Während des Kaufprozesses, sicher sein, die Proben im Fokus zu halten durch sorgfältige Einstellung des Knopfes nach Bedarf. Wenn die Bilder gesammelt werden, sollte die PALM-Analyse durchgeführt werden. Für tdEos, filtern wir keine Signale, die länger als 500 ms fluoreszieren, da diese Signale zu erwarten sind aufgrund der Autofluoreszenz. 6. SEM Imaging Vor SEM Bildgebung, färben die Abschnitte mit 2,5% Uranylacetat (in Wasser) für 4 min. Waschen Sie die Uranylacetat gründlich mit gefiltertem milliQ Wasser. Nachdem die Teile getrocknet sind, Sputter-Kohlenstoff-Schicht das Deckglas mit einem Kohlenstoff, bis das Deckglas wird ziemlich dunkel. Anwenden einem Ende des Kohlenstoff-leitenden Band am Rand des Deckglases und dem anderen Ende auf dem Metall Stub so daß Elektronen, die auf die Oberfläche des Deckglases akkumulieren geerdet sind. Montieren Sie die Probe in die SEM Kammer (FEI Nova Nano). Legen Sie die VCD-Detektor. </li> Schließen Sie die Kammer und pumpen es über das Hochvakuum-Einstellung. Sobald evakuiert, öffnen die Spalte Ventil, so dass Elektronenstrahl auf eine Probe aufgebracht wird. Führen Sie eine Routine Ausrichtung des Elektronenstrahls. Suchen Sie die Probe. Sobald der Fokus eingestellt ist, verbinden die Probe Bühne und bringen die Bühne, um 5 mm unter dem Polstück. Nehmen einer schwachen Vergrößerung Bild der Probe (~ 5,000 x). Zoom in die Region des Interesses und erhalten hohe Vergrößerung (50.000 x) Bilder. Gehen Sie zum nächsten Abschnitt, und wiederholen Sie Schritt 6,10) und 6,11), bis alle Abschnitte abgebildet werden. 7. Ausrichten PALM-und EM-Images Öffnen Sie Photoshop und die erworbenen REM-Aufnahmen. Erstellen Sie ein neues Fenster mit einer Größe von 5.000 x 5.000 Pixel und 300 Pixel / Zoll Auflösung. Kopieren Sie die geringer Vergrößerung REM-Aufnahme in das neue Fenster (Abbildung 1A). Skalieren Sie das Bild so, dass es fülltdas gesamte Fenster mit der Transformation Manipulation (Command + T für Mac). Kopieren Sie die höhere Vergrößerung REM-Aufnahmen und skalieren sie als notwendig. Drehen Sie die Summe TIRF Bild horizontal, indem Sie Bildrotation aus dem Bild Dropdown-Menüleiste. Kopieren und fügen Sie die Summe TIRF Bild (von PALM) in eine neue Ebene. Skalieren des Bildes unter Verwendung des Transformationskoeffizienten Manipulation und dann drehen, wenn nötig, um die Fluoreszenz der Goldpartikel (weiße Pfeile in 1A) mit den entsprechenden Strukturen in visualisiert SEM (1B) übereinstimmen. Kopieren Sie den PALM Bild in eine neue Ebene und die gleiche Transformation (Abbildung 1C). Eine stärkere Vergrößerung Bild kann von diesem Bild (Bild 2) extrahiert werden. Für die Präsentation, kopieren Sie die verwandelt PALM Bild in eine neue Ebene. Wählen Sie die PALM-Signale aber nicht Hintergrund mit "Farbbereich" in der "select" drop-down Menü. Achten Sie darauf, select ein Hintergrund-Pixel als Referenz Pixel und schalten Sie den "invertieren"-Option. Schneiden Sie die gewünschte PALM Signale und fügen Sie sie in eine neue Ebene. Transparenz anwenden, um die Hintergrund-Ebene, und setzen Sie ihn auf 10%. Dies ermöglicht die Visualisierung der PALM-Signale, indem der Hintergrund transparent, ohne ihre Intensität (2D). 8. Repräsentative Ergebnisse Histone mit tdEos getaggt stabil in dem Fadenwurm C. ausgedrückt werden elegans, sowie die transgenen Tiere wurden unter Anwendung des oben beschriebenen Protokolls. Die PALM und elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden aus dem gleichen Abschnitt (Abbildung 1) erworben. Um die Bilder auszurichten, wird die Summe TIRF Bild, das die Fluoreszenz über die gesamte zeitliche Verlauf summiert, auf der elektronenmikroskopischen Aufnahme überlagert. Die Gold-Nanopartikel werden in beiden der Fluoreszenz und elektronenmikroskopische Aufnahmen und kann verwendet werden, um die beiden Bilder unter Verwendung der 'transf auszurichtenorm "-Funktion in Photoshop (Abbildung 1A und B). Dann wurde die gleiche "transform" Wert der PALM Bild (Abbildung 1C) angewendet. Bei dieser Vergrößerung können strukturelle Detail nicht unterschieden werden, so dass wir in einer Region nahe dem oberen Ende der Aufnahme (Abbildung 2) vergrößert. In der hohen Vergrößerung Bild, könnte subzellulären Details wie ein Kern, ein Nukleolus, Kernporen und endoplasmatischen Retikulum beobachtet werden. Darüber hinaus werden die markierten Moleküle Histone ausschließlich dem Kern lokalisiert, aber nicht an den Nukleolus, wie erwartet. Das korrelative PALM und Elektronenmikroskopie ermöglicht somit Proteinlokalisierung mit der höchsten Auflösung. Fünf Probleme beeinträchtigen die Qualität der Bilder. Erstens kann Eiskristall Schäden verzerren Ultrastruktur (3A und B). Anordnen Proben in einem Cryo-Schutzmittel wie Bakterien, das die Vermehrung von Eiskristallen reduziert, können diese Schäden zu reduzieren. Dennochmuss man noch screenen Proben mittels Elektronenmikroskopie und entsorgen die mit dem Einfrieren Artefakte. Zweitens bedeutet GMA kein Cross-Link zu Geweben wie Epoxidharze und somit Proben oft losbrechen aus dem umgebenden Kunststoff und strecken, schrumpfen oder sogar fallen aus dem Abschnitt (3C und D). Präparation der Probe weg von den Bakterien oder anderen Kryo-Schutzmittel vor dem Einbetten sieht eine stärkere Haftung des Kunststoffs an die Probe (3C). Ähnlich Strukturen wie Lipidtröpfchen im Darm oft aus dem Gewebe durch das Fehlen der Vernetzung (3E) zu distanzieren. Drittens, die unvollständigen Polymerisation von Kunststoff Ursachen Dehnen oder Falten des Gewebes (3F), die Anwesenheit von Sauerstoff in der Probe behindert auch die Polymerisation von GMA. Viertens, die schlechte Schnitte Qualität der GMA resultiert oft in einem inkonsistenten Morphologie (Abbildung 3G und H). GMA Abschnitten sollte geschnitten werden70 nm oder dicker und mit einer Geschwindigkeit von etwa 1,6 mm / s bis zu minimieren sectioning Artefakte. Fünftens Hintergrund-Autofluoreszenz von Staub auf dem Deckglas oder Abschnitt ist unvermeidlich. Autofluoreszenz von Staub kann durch die Verwendung vorgereinigt Deckgläser und durch die Vermeidung von Staub und Verunreinigungen aus Kimwipes Filterpapier wie im Protokoll beschrieben minimiert werden. Die PALM Analyseprogramm bearbeiten können Signale von der Probe oder Kunststoff, der mehr fluoreszieren als typische Signale von fluoreszierenden Proteinen (Abbildung 2 A und B). Das fertige Bild wird daher frei von solchen Artefakten. Abbildung 1. Ausrichten Fluoreszenz-und elektronenmikroskopische Aufnahmen mit Gold-Nanopartikeln. (A) Eine geringe Vergrößerung Elektronenmikroskopaufnahme aus einem Querschnitt von C. elegans Ausdruck der markierten Histon tdEos :: HIS-11. White einrrows anzuzeigen 100 nm Elektron-dichte Gold-Nanopartikel aufgetragen vor PALM Bildgebung, die als Markierungszeichen dienen. (B) Die Gold-Kügelchen fluoresziert bei Bestrahlung mit ~ 580 nm Licht und schaffen Markierungszeichen im Fluoreszenz-Bild. Die Summe TIRF Bild wird auf einer elektronenmikroskopischen Aufnahme von der Lage der Markierungszeichen Basis ausgerichtet ist. Die Summe TIRF Bild repräsentiert alle Photonen, die durch die Kamera während der experimentellen Zeitverlaufs detektiert. Beachte, dass die helle Flecken auf der oberen linken (weißer Pfeil) aus den Clustern von Goldpartikeln entstehen. (C) Ein PALM Bild wird dann auf der elektronenmikroskopischen Aufnahme und gedreht zugegeben und übersetzte basierend auf den Werten von der Ausrichtung der Summe TIRF Bild in (B) bestimmt. Hier eine größere Zahl anzuzeigen . <br /> Abbildung 2. Correlative nano-FEM mit Histone Fusionsproteine. (A) Summe TIRF Bild tdEos :: HIS-11 aus einem dünnen Abschnitt (70nm) erworben. (B) Entsprechende PALM Bild tdEos :: HIS-11. Autofluoreszenz (weißer Pfeil), die länger als 500 ms wurde von der PALM-Programm gefiltert. (C) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Zellkerns erworben aus dem gleichen Abschnitt. (D) Correlative PALM Bild-und elektronenmikroskopische Aufnahme tdEos :: HIS-11. Fluoreszenz dicht mit dem Chromatin im Zellkern lokalisiert. Abbildung 3. Probleme mit nano FEM verbunden. (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines C. elegans Muskelgruppen des Körpers ohne Eis-Kristall Schaden. (B) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Körpers Muskel mit Eiskristall Schäden. Anstatt diskrete Querschnitte sind Aktin und Myosin-Filamente in Aggregate aufgrund der Bildung von Eiskristallen eingeklappt. (C, D) mit niedriger Vergrößerung Elektronenmikroskopaufnahmes, welche die Dissoziation von Würmern aus den umgebenden Medien. Der Abschnitt ist stärker verzerrt in einer Probe, die durch die Kryo-Schutzgruppe Bakterien (D), als wenn die Probe durch Kunststoff (C) umgeben ist. Die bakterielle Cryo-Schutzmittel in der gallette sollte weg von der fixierten Probe vor der plastischen Einbettung seziert werden. Beachten Sie, dass das Tier auf der rechten Seite von (D) schräg geschnitten war, und somit die Form ist nicht auf die Verzerrung von Gewebe. (E) Elektronenmikroskopische Aufnahme von Darm, zeigt Aussetzer von Geweben (schwarze Pfeile). (F) Elektronenmikroskopische Aufnahme von Nerven-Ring, zeigt Falten der Abschnitte aufgrund der unvollständigen Polymerisation von Kunststoff (schwarze Pfeile). (G, H) Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Neuronen aus der gleichen Probe, geteilt zu unterschiedlichen Terminen. Die Erhaltung von Geweben ist hervorragend an einem Tag (G), aber solche Morphologie wird durch die uneinheitliche sectioning Qualität (H) verdeckt. Klicken Sie hier, um view größere Figur.