نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني
Summary
وصفنا طريقة لتوطين البروتينات fluorescently المفتاحية في micrographs الإلكترون. يتم ترجمة باستخدام صور 1 مضان المجهري تنشيط الترجمة في أقسام سامسونج. ثم يتم محاذاة هذه الصور لmicrographs الإلكترون من نفس القسم.
Abstract
رسم خرائط توزيع البروتينات ضرورية لفهم وظيفة البروتينات في الخلية. ويستخدم على نطاق واسع لتوطين مضان المجهري البروتين، ولكن السياق التحت خلوية غالبا ما تكون غائبة في الصور مضان. المناعية الإلكترون المجهري، من ناحية أخرى، يمكن ترجمة البروتينات، ولكن يقتصر تقنية بسبب عدم وجود الأجسام المضادة متوافقة، وحفظ الفقراء من التشكل، ولأن عدم تعرض معظم المستضدات على سطح العينة. ويمكن للنهج مترابط الحصول على صورة مضان من خلية كاملة الأولى، سواء من المناعة أو البروتينات الموسومة مضان وراثيا. ثم يتم إصلاح العينة وجزءا لا يتجزأ من لالمجهر الإلكتروني، وترتبط الصور 1-3. ومع ذلك، فإن الصورة منخفضة الدقة مضان وعدم وجود علامات إيمانية يمنع التوطين دقيقة من البروتينات.
وبدلا من ذلك، يمكن القيام مضان التصوير بعد الحفاظ على عينة من البلاستيك. فيهذا النهج، هو كتلة مقطوع، وترتبط الصور مضان وmicrographs الإلكترون من نفس القسم 4-7. ومع ذلك، فإن الحد حيود الضوء في الصورة المترابطة يحجب المواقع من الجزيئات الفردية، ومضان غالبا ما يتجاوز حدود الخلية.
تم تصميم نانو القرار المجهر الإلكتروني مضان (نانو FEM) لتوطين البروتينات في مقياس النانو من قبل أقسام التصوير باستخدام نفس الصورة تنشيط الترجمة المجهر (PALM) والمجهر الإلكتروني. PALM يتغلب على الحد حيود من البروتينات الفلورية الفردية التصوير ورسم الخرائط لاحقا النقطة الوسطى من كل بقعة 8-10 الفلورسنت.
نحن الخطوط العريضة لتقنية النانو FEM في خمس خطوات. أولا، يتم إصلاح العينة وجزءا لا يتجزأ باستخدام الشروط التي تحفظ مضان من البروتينات ذات الكلمات الدلالية. الثانية، هي لبنات الراتنج مقطوع الى شرائح سامسونج (70-80 نانومتر) التي يتم تحميلهاعلى الزجاج غطاء. الثالث، هو تصوير هذه المقاطع في مضان باستخدام المجهر PALM زايس. الرابعة، وتصوير المنشآت كثيفة الإلكترون في هذه المقاطع نفسها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح. الخامسة، يتم محاذاة micrographs الإلكترون ومضان باستخدام جزيئات الذهب كعلامات الإيمانية. وباختصار، يمكن تحديد توطين التحت خلوية من البروتينات الموسومة fluorescently في القرار نانومتر في أسبوع واحد تقريبا.
Protocol
Discussion
هنا نحن تصف كيفية الحفاظ على البروتينات الفلورية في البلاستيك، وتوطين البروتينات الفلورية في الفروع، وصورة التركيب الدقيق باستخدام المجهر الإلكتروني. تم ترجمة البروتينات أقل من الحد الحيود باستخدام المجهر PALM بالقرار نانومتر. للتكيف مع هذا البروتوكول إلى عينات خاصة، ينبغي النظر في المعايير التالية: fluorophore، الكمي، والمحاذاة.
اختيار بروتين فلوري أو fluorophore العضوية تعتمد على الطلب والنظام النموذجي. لقد اختبرنا مجموعة متنوعة من البروتينات الفلورية، بما في ذلك EGFP، YFP، السترين، mEosFP، mEos2، tdEos، mOrange، PA mCherry، وDendra 12. كان الحفاظ على مضان من كل fluorophore مماثلة، مما يوحي بأن لا يمكن الحفاظ جميع البروتينات الفلورية باستخدام الطريقة الموصوفة. اخترنا tdEos لأنه أعرب بشكل جيد في C. ظلت البروتينات ايليجانس والفنية عندما تنصهر لtdEos، ولأن لهاكانت الصور تفعيل الخصائص الأمثل للفحص المجهري PALM. ومع ذلك، فقد تم تجميع أو فشل تعبير عن tdEos أحيانا يشاهد 12.
بالاعتماد على التطبيق، قد fluorophore مختلفة تكون في وضع أفضل. في كثير من الحالات، فإنه ليس من الضروري استخدام البروتين المنشط الصور الفلورسنت. بسيطة المجهر الإلكترون المترابطة مضان الصورة لا يتطلب تنشيط بروتين الفلورية. ويمكن استخدام GFP أو الأصباغ العضوية لمضان صورة من البروتينات في أقسام الموسومة فوق الحد الحيود. على سبيل المثال، يمكن للمرء صورة محور عصبي في neuropil باستخدام المجهر مضان وربط إشارة مضان مع محور عصبي معين في صورة مجهرية الإلكترون عن طريق التصوير مضان المجهر على مضان. أخرى فائقة القرار التقنيات، مثل الانبعاث المستحث المجهر استنزاف (STED) 12، المجهري الأرض استنزاف الدولة تليها عودة جزيء الفردية (GSDIM) 13، ومنظم الإضاءة المجهر (SIM) 14، لا تحتاج الصورة تنشيط البروتينات الفلورية. وعلاوة على ذلك، فائقة القرار تقنيات التصوير التي تستخدم الأصباغ العضوية 9،15،16 أو الملكية لا يتجزأ من تحقيقات الفلورسنت 17 هي سهلة التطبيق.
في PALM، يمكن تحديد عدد من الجزيئات لأن يتم فصل كل جزيء من مضان مكانيا وزمانيا. ومع ذلك، قد يكون مضللا الكمي لأربعة أسباب: أكسدة، الحساب الدقيق، overcounting، و overexpression. أولا، يمكن التشويه والتحريف جزء صغير من البروتينات الفلورية أو المؤكسد خلال تجهيز العينات 5،12. على الرغم من الحفاظ على ~ 90٪ من إشارة مضان من خلال تثبيت وتضمينها في البروتوكول الخاص بنا، فقد أكسدة البروتين الفلوري تحدث بعد العينة كان مقطوع والسطح المعرض للأكسجين. ثانيا، تفعيل الصور activatable البروتينات هو مؤشر ستوكاستيك، وبالتالي يمكن أن تكون الجزيئات متعددةتنشيط في مكان معين الحيود محدودة 8. ومضان من جزيئات متعددة تظهر بقعة واحدة، وبالتالي سيتم قلل من العدد الإجمالي للبروتينات. الثالث، يمكن أن يؤدي إلى مشكلة مماثلة overcounting. في PALM، يتم ترجمة كل بروتين فلوري ثم "مسح" من قبل التبييض. ومع ذلك، يمكن العودة من البروتينات الفلورية الدولة دون أن تكون مقصورة الظلام بشكل دائم 18. ومثل هذه الجزيئات ثم تحسب عدة مرات. يتم التعبير عن الرابعة، ويوصف بانه البروتينات الجينات المحورة وغالبا يوجد في نسخ متعددة، والتي يمكن أن تؤدي إلى overexpression. ولذلك، يمكن استخدام القياس الكمي من PALM لتقدير ولكن لا يحدد بدقة عدد الجزيئات في موقع معين.
يمكن محاذاة صورة PALM مع صورة مجهرية الإلكترون أيضا أن يكون تحديا بسبب الاختلاف في القرار المجهر الضوئي والإلكتروني والتشويه الناجم عن شعاع الالكترون. جزيئات الذهب تعمل بإحكام كما في الموضعalized علامات إيمانية في micrographs الإلكترون. ومع ذلك، fluoresecence من جزيئات الذهب ليست الصورة تفعيلها، ويظهر على شكل بقعة حيود محدودة كبير. وهكذا، فإن وضع صورة مضان عبر صورة مجهرية الإلكترون هو تقدير. يمكن أيضا التشوهات تنشأ من التفاعلات الإلكترونات مع قسم البلاستيك. راتنجات الاكريليك مثل GMA أقل استقرارا تحت شعاع الالكترون، ويمكن تغيير أبعاد البلاستيك. وفي ظل هذه الظروف، قد محاذاة مضان مع التركيب الدقيق تتطلب غير الخطية التحول من علامات إيمانية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر هارالد هيس واريك Betzig للوصول إلى PALM المجهر لإثبات صحة المبدأ التجارب، ريتشارد القيد لتبادل بروتوكولات التثبيت والكواشف والتشجيع. نشكر مايكل ديفيدسون، Seydoux جيرالدين، Eimer ستيفان، Leube رودولف، Nehrke كيث والمسيحية Frøkjr-جنسن، AUDE ادا نغيما وHammarlund مارك ليبني DNA. كما نشكر شركة كارل زايس لتوفير الوصول إلى زايس PAL-M، إصدار بيتا من المجهر Elyra زايس PALM P.1.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalog number | Comments |
| High-pressure freezer | ABRA | HPM 010 | EMPact and HPM 100 from Leica or hpf-01 from Wohlwend can also be used. |
| Automated freeze substitution unit | Leica | AFS 2 | AFS 1 can also be used. |
| Zeiss PALM | Zeiss | ELYRA P.1 | Nikon and Vutara also sell commercial PALM microscopes. |
| Scanning electron microscope | FEI | Nova nano | Other high-resolution SEM microscopes can be used. |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| Ethanol | Sigma-aldrich | 459844-1L | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19134 | |
| Potassium permanganate | EMS | RT20200 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-aldrich | A3059-50G | |
| Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | pH of uranyl acetate from this company is slightly higher. |
| Glycol methacrylate (GMA) | SPI | 02630-AA | Low acid, TEM grade. |
| N,N-Dimethyl-p-toluidine | Sigma-aldrich | D9912 | |
| Cryo vials | Nalgene | 5000-0020 | |
| Glass vials | EMS | 72632 | |
| Aclar film | EMS | 50425-10 | |
| BEEM capsule | EBSciences | TC | Polypropylene |
| 3/8″ DISC punches | Ted Pella | 54741 | |
| Gold nanoparticles | microspheres-nanospheres.com | 790122-010 | Request 2x concentrated solution |
References
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
- Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers. Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).
- Bishop, D., et al. Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy. Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).
- Sims, P. A., Hardin, J. D. Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy. Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).
- Micheva, K., Smith, S. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Weibull, C., Christiansson, A. Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy. J. Microsc. 142, 79-86 (1986).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- F lling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). PNAS. 106, 22287-22292 (2009).
- Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules. PNAS. , (2011).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
