Controlando o tamanho, forma e estabilidade de Polímeros Supramoleculares na Água

Esquema 1. Auto-montagem de BTA baseados discotics em tampão de citrato em agregados esféricos mostrando diâmetros de cerca de 5 nm, em concentrações milimolares de bloco de construção. O aumento da força iónica pela adição de NaCl resultados na formação de hastes alongadas, com um diâmetro de cerca de 3 nm e comprimento de menos de 25 nm. para ver figura maior . 1. Preparando um BTA-Gd (III) DTPA Soluções para CD Espectroscopia e medição da temperatura-dependente Spectra CD como uma função da concentração de NaCl Preparar um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0). Preparar um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0) com 2 M de NaCl. Dissolve-se 0,254 mg de BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol -1) em 10 mL de tampão de citrato 100 mM, target concentração 8 • 10 mM -3 de BTA-Gd (III) DTPA. Sonicar a solução durante 5 minutos. Encher uma cuvete 1 centímetro de UV com a solução e medir um espectro de CD a partir de 230 a 350 nm e uma curva de arrefecimento CD na maior banda intensidade CD (por exemplo, lambda = 269 nm) 363-283 K, a uma taxa de 1 K min – 1. Adicionar o mesmo volume de 2 M de NaCl tamponado solução para o citrato de solução tamponada de TBA-Gd (III) DTPA, a fim de aumentar a força iónica para 1 M de NaCl, diluindo as discotics a metade da concentração, a concentração alvo 4 • 10 -3 mM de TBA-Gd (III) DTPA. Vortex da solução com o aumento da força iônica por 5 minutos. Remensurar um espectro de CD a partir de 230 a 350 nm e uma curva de arrefecimento CD na maior banda intensidade CD 363-283 K, a uma taxa de 1 K min -1. 2. Ajuste dos dados T-dependentes de CD para um modelo para T-dependement Auto-montagem Os dados do CD-primas foram exportados para Origin 8.5 e normalizado. Isto foi conseguido através da definição de o efeito de CD na maior temperatura medida como igual a 0, eo efeito de CD no nível mais baixo de temperatura medida como igual a 1. Uma vez que a magnitude do CD-efeito é proporcional ao grau de agregação 8, as curvas normalizadas CD-se proporcional ao grau de agregação. Os dados normalizados foram ajustados usando a opção de ajuste não-linear da curva em OriginPro 8.5 usando um T-dependente modelo de auto-montagem obtidos por van der Schoot 8,9. Neste modelo, uma nucleação e um regime de alongamento são distinguidos. Primeiro, o grau de agregação do regime de alongamento (T <t e) foi montado, usando a seguinte equação: equação acima contém (próximo da temperatura variável, t, eo grau de aggregation e Φ n) três parâmetros; isto é, entalpia alongamento h, o t (a que auto-montagem é iniciado) parâmetro sat, qual introduzido para assegurar n > • s -1. Como referência, a auto-difusão de HDO em D 2 O foi medida num Hz 2 VARIAN D 2 O padrão da amostra e calibrado para o seu valor padrão. O modelo utilizado para calcular o hidrodinâmico raios R H dos agregados é a relação de Stokes-Einstein para a difusão de uma partícula esférica. 5. Os resultados representativos 1 H-RMN DOSY e as medições de SAXS sobre DTPA-BTA-M (III): objectos esféricos, em tampão de citrato O carácter iónico dos periféricos Gd (III) os complexos introduz frustração no crescimento unidimensional dos monómeros discotic cujo núcleo é concebido para polimerizar em alongadas haste-como agregados. O equilíbrio entre as interacções atractivas e repulsivas controla o tamanho ea forma dos agregados (Esquema 2). Esquema 2. Uma técnica poderosa para determinar o tamanho ea forma de partículas em solução é a fonte de sincrotrão pequeno ângulo de raios-X de espalhamento (SAXS). BTA-Gd (III)-DTPA foi dissolvido numa solução tampão de citrato e os perfis de SAXS foram gravadas e equipado na região 0,01 <q <0,1 Å -1. a inclinação se aproximando de zero na região baixo-q (q <0,06 -1) indica uma falta anisotropia forma, no total, sugerindo presença objetos esféricos (figura 1). os dados medidos em diferentes concentrações foram ajustados usando um homogénea monodispersos factor forma esférica que conduz raio calculado, r, 3,2 nm. o calculado geométrica discotic monomérica bta-gd (iii)-dtpa é 3,0 nm, sugere agregados com relação aspecto próxima 1. <br /> Figura 1. Perfis de SAXS para BTA-Gd (III)-DTPA em tampão citrato (100 mM, pH 6), 0,5 e 1,0 mM (em cima). DOSY RMN de BTA-Y (III)-DTPA em 50 mM tampão d 6-succinato a 1,0 mm (inferior). Clique aqui para ver maior figura . A fim de proporcionar evidência adicional para a forma esférica e nanómetro tamanho dos objectos de auto-montagem, foi realizada uma difusão H-ordenada espectroscopia de RMN (1 H-RMN DOSY) (Figura 1). DOSY-RMN permite a determinação dos coeficientes de difusão de agregados, a partir do qual o raio hidrodinâmico (R H) pode ser calculada. Uma vez que Gd (III) é altamente paramagnético e 1 sinais H seria assim aumentado significativamente, mudamos Gd (III) para diamagnético Y (III). Os coeficientes de difusão do anfifilo diamagnético agregado discotic em um tampão de succinato deuterado (50 mM, PH 6, c = 1 mM) foi determinado para ser 0.69×10-10 m 2 s -1. Via a relação de Stokes-Einstein, calcula-se um raio R hidrodinâmico H de 2,9 nm para os objectos discretas de tamanho esférica (Tabela 1). Este tamanho é em excelente concordância com o valor obtido a partir de dados de SAXS para BTA-Gd (III)-DTPA. BTA-M (III)-DTPA [Mm] D t a [10 -10 m 2 s -1] R H uma [Nm] R b [Nm] 1 0,69 2,9 3,2 um de DOSY; b de SAXS Tabela 1. Resultados de SAXS e medições DOSY para DTPA-BTA-M (III). Cryo-TEM em BTA-Gd (III)-DTPA: a partir de objectos esféricos para nanorods alongadas Outra evidência para o sucesso do controle sobre unidimensional comprimento pilha foi obtido a partir de crio-micrografias TEM. Devido à vitrificação das soluções aquosas criogénico MET preserva a morfologia estrutural dos agregados de auto-montagem e evita a secagem afecta relacionada com a preparação convencional MET amostra. Figura 2 (à esquerda) mostra que BTA-Gd (III)-DTPA produz o esférica esperado objectos com diâmetros cerca de 6 nm, a uma concentração 1 mM, o que confirma os resultados de SAXS e medições DOSY. De acordo com estes resultados, temos sido capazes de obter auto-montagem de objetos discretos que podem ser considerados o equivalente supramolecular de macromoléculas dendríticas 10. . Figura 2 Cryo-TEM imagens para BTA-Gd (III)-DTPA (à esquerda) 1 mM vitrificados a 298 K em tampão citrato (100 mM, pH 6), uma barra de escala representa 50 nm;(À direita) 1 mM vitrificados a 298 K em tampão citrato (100 mM, pH 6) e uma concentração total de NaCl de 5 M, barra de escala representa 50 nm. Até agora, só trabalhou em soluções tamponadas de baixa força iônica. No entanto, se electrostáticas forças repulsivas do periférica carregada M (III)-DTPA complexos em BTA-Gd (III)-DTPA estão na origem do crescimento unidimensional frustrado, esperávamos que o aumento da força iónica do meio tamponado, usando um sal 1:1 inerte com contra-iões altamente hidratadas, deve reduzir as interacções electrostáticas e, portanto, um tipo diferente de auto-montagem objecto deve ser formada. Em tampão de citrato compreendendo 5 M de NaCl este efeito foi realmente observada (Figura 2, direita). A formação de relação de aspecto alto haste-como polímeros supramoleculares é claramente observado na crio-MET micrografias em força iónica elevada. Blindagem electrostática é a explicação mais provável para este achado. As alterações de forma a partir de uma SPHEagregada rical de cerca de 6 nm de diâmetro para hastes alongadas, com um diâmetro de 6 nm e comprimento de até várias centenas de nanómetros. Medições de CD de DTPA-BTA-Gd (III): comutação em cooperação auto-montagem, aumentando a força iónica Dicroísmo circular, espectroscopia (CD) mede a diferença de absorção entre canhotos e destros luz polarizada circularmente. Quando um objecto helicoidal tem um sentido preferido helicoidal, deixou-e destros luz polarizada circularmente será absorvido em diferentes graus, portanto, dando origem a um CD-efeito. Uma vez que as ligações de hidrogénio intermoleculares formado entre consecutivo BTA-Gd (III)-DTPA, dentro dos agregados, são alinhados em uma forma helicoidal eo centro estereogénico na porção L-fenilalanina favorece um sentido helicoidal sobre o outro, espera-se uma clara CD espectro de BTA-Gd (III)-DTPA agregados baseados 11,12. Além disso, dependente da temperatura espectroscopia de CD é um poderosoferramenta para avaliar o mecanismo de auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA polimerização e permite tirar conclusões sobre a estabilidade dos agregados formados 13. Como um exemplo, o quarto espectros de CD temperatura de BTA-Gd (III)-DTPA (mM 8×10 -3 ou mM 4×10 -3 num tampão de citrato 100 mM) com aumento da concentração salina (0 M de NaCl a 1,0 M de NaCl) são dadas na Figura 3A. Embora uma concentração significativamente inferior é aplicada para as medições de CD, o efeito de algodão claro indica a presença de agregados intactas, mesmo em concentrações micromolares. A forma das alterações espectro de CD sobre o aumento da concentração de sal, que é uma boa indicação para interacções reduzidas na periferia das pilhas e melhor de embalagem das discotics. Além disso, as curvas de CD de arrefecimento das mesmas soluções (363-283 K, medido a λ = 269 ou 278 nm) mostram diferenças distintas de forma (Figura 3B). O appai T e-a temperatura à qual a agregação inicia-se desloca para temperaturas mais elevadas na maior concentração de sal e um mecanismo de cada vez cooperativa, caracterizada por um aumento mais abrupta na CD-efeito, torna-se aparente. Considerando que a curva de arrefecimento a 0 M de NaCl é melhor descrita por um processo de auto-montagem isodésmicas, a curva de arrefecimento a 1,0 M de NaCl é típico para um processo de auto-montagem cooperativa 14. No primeiro caso, todas as constantes de associação são assumidos como sendo igual ao passo que no último caso, a auto-montagem ocorre em pelo menos duas fases distintas. No primeiro passo, um "núcleo" precisa de ser formado, que é energeticamente altamente desfavorável. Após arrefecimento abaixo de uma temperatura de polimerização crítico, alongamento e de crescimento exponencial em polímeros supramoleculares de alto peso molecular segue. Quantificar os parâmetros termodinâmicos do auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA em 0 e 1 M de NaCl, utilizando um modelo de cooperativa revela claramente a diminuição na K <sub> um, que é a activação adimensional constante 8. Os valores mais baixos para K uma indicam um grau mais elevado de cooperatividade no processo de auto-montagem, que é expresso na formação de polímeros altamente alongadas supramoleculares como observado em crio-MET. BTA-Gd (III)-DTPA C NaCl K um 8 mM x10 -3 0 M 5 10 -2 4 mM x10 -3 1 M 1 10 -4 Tabela 2. Grau de cooperatividade expressa por um K na dependente da temperatura de auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA como uma função da concentração de NaCl (C NaCl). Figura 3. BTA-Gd (III)-DTPA em um tampão de citrato 100 mM (c = 8 mM x10 -3 em força iónica baixa e 4 mM x10 -3 em força iónica elevada) A] espectros de CD registada a 293 K como uma função da força iónica , c NaCl = 0 M – 1,0 M, a Δε elipticidade molar é calculada como se segue: Δε = CD efeito-/ (cxl), em que c é a concentração de TBA em mol L -1 e l é o comprimento do percurso óptico em centímetros ; B] curvas CD correspondente arrefecimento medidos em λ = 269 nm para 0 M de NaCl e 278 nm para soluções 1 M de NaCl expressa como o grau de agregação Φ n como uma função da concentração de NaCl c NaCl = 0 M – 1,0 M, Φ n é calculado dividindo o efeito medido CD-pelo máxima CD-efeito.