Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em> In vivo</em

1. Preparare aghi Dye rivestite Elettroliticamente affinare un micron di diametro filo di tungsteno 15 160. Aghi diametro punta finale dovrebbero variare 5-50 micron. Il numero di aghi necessari dipende dalla dimensione della regione di essere etichettati. Abbiamo preparato 5 aghi per 3-5 iniezioni nel nucleo exterolateral posteriore (ELP). La notte prima dell'esperimento, una goccia (<0,25 ml) di 2 mm destrano coniugato con Alexa Fluor 10.000 MW inchiostri a pigmenti sul distali 100 micron di ogni ago. Lasciare gli aghi di aria secca a temperatura ambiente, senza colorante concentrato sulla punta. Memorizzare gli aghi a 4 ° C in un contenitore scuro per proteggerle dalla luce. 2. Preparare animali di Chirurgia Indurre anestesia generale mettendo il pesce in una soluzione di 300 mg / L MS-222 in acqua serbatoio. Pesare il pesce e la misura di lunghezza della forcella (punta del muso alla forcella di pinna caudale) e la profondità del corpo (massima dorso-Ventradistanza L nel piano trasversale). Queste misurazioni dovrebbero rientrare nei range indicato in Tabella 1 in modo che il pesce si inserisce all'interno di una camera di registrazione abbastanza piccolo da mettere sotto un obiettivo microscopio immersione in acqua (Figura 1). Immobilizzare e zittire elettricamente il pesce, iniettando 100 ml di 3 mg / ml flaxedil nella muscolatura dorsale del corpo. Riempire la camera di registrazione (Figura 1A), con serbatoio acqua. Posizionare il pesce ventrale rivolto verso il basso sulla piattaforma nel centro della camera (Figura 1). Fornire una soluzione aerata di 100 mg / L MS-222 usando un puntale posizionato nella bocca del pesce (1-2 ml / min). Stabilizzare il pesce con barre fissate in cera posizionati su entrambi i lati del corpo (Figura 1C). Monitorare la salute del pesce controllando il flusso di sangue continuo nei vasi oculari e un normale colore della carrozzeria. Ruotare la piattaforma lungo il suo asse lungo ed abbassare l'estremità posteriore del platfOrm modo che un lato della superficie dorsale della testa del pesce è esposta sopra l'acqua, mentre il resto del corpo del pesce rimane sommerso. Un piccolo pezzo di Kimwipe deve essere posizionato su qualsiasi parte non sommersa della pelle contro l'essiccamento. 3. Chirurgia (Figura 2) La procedura chirurgica di base qui descritta è ben consolidata e affidabile utilizzato per non vedenti nelle registrazioni in vivo su mormiridi 16. Per altre applicazioni, esporre le regioni desiderati per l'etichettatura e la registrazione. La regione contenente terminali degli assoni delle cellule di interesse deve essere raggiungibile da un ago colorante rivestita. La regione contenente segmenti più prossimali di quegli stessi assoni deve disporre di spazio sufficiente sopra il tessuto per ospitare la distanza di lavoro della lente immersione in acqua (2 mm nostro caso). Applicare una soluzione 0,4% di lidocaina alla superficie esposta della testata utilizzando un Q-tip. Usando un bisturi, tagliare il perimetro di un pezzo rettangolare di pelle. Rimuovere il rettangolo utilizzando un paio di pinze. La dimensione del rettangolo si adatterà dimensioni pesci, ma dovrebbe essere di circa 3 mm x 5 mm per un pesce 6,2 cm (Figura 2A). Il bordo laterale del rettangolo dovrebbe allinearsi con il centro dell'occhio, il bordo anteriore del rettangolo dovrebbe essere solo posteriore e l'occhio, e il bordo mediale del rettangolo dovrebbe essere solo laterale della linea mediana del pesce. Espandere la regione cranio esposto anteromedialmente per esporre un ulteriore 2,5 mm Area non sovrapposte quadrato (Figura 2B). Tutto chiaro e asciugare la superficie esposta del cranio con la lama del bisturi per raschiare via qualsiasi tessuto e Kimwipes eccesso e aria forzata per asciugare la superficie (Figura 2C). Incollare un palo di metallo alla regione antero-mediale cranio esposto usando Super Glue. Attendere fino a quando la colla è completamente asciutta (Figura 2D). </li> Rimuovere un rettangolo di cranio, circa 2 mm x 4 mm per un cm di pesce 6.2. Utilizzare un trapano dentistico con una ~ 0,5 millimetri di diametro palla mulino punta in metallo duro per assottigliare il perimetro del rettangolo. Poi, utilizzando un bisturi e pinze, tagliare il perimetro del rettangolo e buccia via per esporre il cervello sottostante. Perforazione supplementare o il taglio con forbici piccole possono essere necessarie per esporre completamente EL (Figura 2E). Se si verifica sanguinamento muscolare, un'unità elettrocauterizzazione può essere usato. Tagliare sia la dura madre (pigmentato) e la pia madre (chiaro) con le forbici a molla o con un ago e rimuovere le parti tagliate con un paio di pinze. Le parti anteriore e posteriore del nucleo exterolateral (EL) sono ora visibili, ELA e ELP, rispettivamente (Figura 3A). 4. Marcatura retrograda degli assoni di interesse Posizionare un manipolatore con un ago colorante rivestito (fatto nel passaggio 1) al di sopra della regione di destinazione contenente assoni di interest, nel nostro caso Elp. Rapidamente inserire l'ago circa 25 micron nel tessuto. Attendere 15-30 secondi, fino a quando tutto il colorante è venuto fuori, e quindi ritrarre l'ago. Ripetere con altri aghi freschi se necessario, mettendo ognuno in una posizione diversa, in modo che il colore è distribuito in tutta la regione di destinazione. Abbiamo usato 3-5 aghi per preparazione. Sciacquare il colorante in eccesso dalla cavità con la soluzione di Ringer Hickman. Attendere almeno 2 ore per l'assorbimento colorante e dei trasporti. 5. Visualizzazione degli assoni di interesse Posizionare la camera di registrazione, insieme ai pesci, sotto l'obiettivo di un montante, fisso stadi microscopio ad epifluorescenza. Come il corpo del pesce occlude penetrazione della luce, fonti di luce sia bianchi e fluorescenti devono venire dall'alto. Posizionamento accurato di una sorgente di luce in fibra ottica al di sopra della cavità del cranio consente immagini campo chiaro soddisfacenti. Per una visualizzazione epifluorescenza, filtro a fluorescenzaspecifiche devono corrispondere l'assorbimento / emissione spettro del colorante. Passare alla respirazione serbatoio acqua fresca e mantenere la stessa velocità di flusso. Posizionare un filo di terra nella cavità cervello esposto e collegare a terra del headstage registrazione (vedere 6.3). Posizionare una coppia di elettrodi di registrazione vicino alla base della coda e collegarsi ad un amplificatore differenziale e dispositivo di registrazione (ad esempio monitor audio, oscilloscopio, o computer) per monitorare il comando scarico organo elettrico (EODC). Dopo il pesce recupera dalla anestesia, il EODC può essere utilizzato come indicatore della condizione del pesce. Preparare un disegno in scala della regione del cervello visto a basso ingrandimento. Includere i principali vasi sanguigni come punti di riferimento (può variare da pesce a pesce) per identificare l'esatta posizione di etichettati assoni visibili solo sotto forte ingrandimento (Figura 3D). Confermare il posizionamento colorante. Primo visualizzare tutto il tessuto con campo chiaro illuminazione per l'orientamento ( <strong> Figura 3A). Poi vedere con illuminazione fluorescente (Figura 3B). ELP avrà etichettatura diffusa (figure 3B e 3C). Ridurre al minimo l'eccitazione di fluorescenza per limitare gli effetti fotodinamica e fototossica del colorante. Utilizzare i vasi come punti di riferimento per individuare ELA in alto ingrandimento. Illuminare con luce fluorescente durante la ricerca di un assone etichetta vicino alla superficie. (Figura 4). 6. Record di attività extracellulare Tirare elettrodi di registrazione di aspirazione utilizzando uno millimetri OD, 0,58 millimetri ID borosilicato capillare di vetro con filamento. Ideale formato di punta dipenderà dal diametro degli assoni bersaglio, che nel nostro caso è 0,1-0,2 micron 17. Per la nostra applicazione, diametro punta dell'elettrodo erano 1,5 ± 0,4 micron (range: 1,0-2,4 micron) con una lunghezza 5 mm, gambo stretto al fine di avvicinare gli assoni etichettati senza spostare il tessuto circostante densamente. Riempire elettrodi con filtrati soluzione suoneria di Hickman. Finale resistenza punta è 45,2 ± 38,0 MW (range: 16-155 MW). Posizionare l'elettrodo in un porta elettrodo con una presa di pressione e collegarlo a un headstage amplificatore montato su un manipolatore. Eseguire una linea di pressione della presa di pressione per un finale incrocio a T in un manometro e una siringa per il monitoraggio e il controllo della pressione, rispettivamente. Collegare l'headstage ad un amplificatore e un dispositivo di acquisizione analogico-digitale. Con 30 mbar di pressione verso l'esterno nella linea di elettrodo, posizionare un elettrodo accanto a un assone etichettato. Una telecamera livello di luce scarsa interfacciato con software di imaging è usato per visualizzare posizionamento pipetta. Avviare vicino alla superficie del tessuto e far avanzare l'elettrodo verso l'assone. Quando ci si avvicina l'assone, la pressione verso l'esterno dovrebbe causare un leggero, ma percettibile movimento del assone. Mentre l'elettrodo si trova accanto al assone, (Figura 4A, in alto) registrare il potenteial all'elettrodo pur presentando stimoli prova (nel nostro caso, abbiamo utilizzato 100 msec monofasici impulsi trasversali positivi e negativi ad una intensità di 20 mV / cm; Figura 1A). I potenziali d'azione non dovrebbero essere osservate, anche se un artefatto elettrico conferma la corretta registrazione / stimolazione (Figura 4A, in basso). Rilasciare la pressione verso l'esterno in elettrodo e ripetere la stimolazione / registrazione. I potenziali d'azione non dovrebbero ancora essere osservati (Figura 4B). Applicare una leggera (125 ± 25 mbar) di aspirazione per l'elettrodo e la stimolazione / registrazione ripetuta. I potenziali d'azione dovrebbero ora essere osservate in risposta alla stimolazione (Figura 4C). Attività spontanea può anche verificarsi. In caso di inosservanza potenziali d'azione, rilasciare l'aspirazione, deselezionare l'elettrodo con una leggera pressione, spostare l'elettrodo leggermente, e tentare di nuovo di aspirazione. Una volta che i potenziali d'azione sono visibili, chiudere la linea di pressione. Stimolare e registrare comedesiderato. 7. Terminazione e smaltimento Una volta che tutte le registrazioni desiderate sono completi, passare alla respirazione con 100 mg / L MS-222 finché il EODC è fermato. No EODC dovrebbe essere rilevata per almeno 10 minuti. Eliminare il pesce in base alle linee guida istituzionali e protocolli per la cura degli animali approvati. 8. Rappresentante dei risultati Per la nostra applicazione particolare, siamo interessati a studiare stimolo di codifica da neuroni sensoriali centrali. Registrazioni di successo da assoni etichettati consentono l'analisi delle risposte-singola unità di stimolazione sensoriale 18. Figura 5A mostra i potenziali di azione di rappresentanza evocati dalla stimolazione electrosensory trasversale con elettrodi bipolari situati sulla parte interna delle pareti sinistra e destra della camera di registrazione. Spike volte può essere presentato come un complotto raster picco (Figura 5B). A 25 msec pre-stimolo vento registrazioneome dimostra il basso livello di attività spontanea. Questo particolare ELA "piccola cella" è di lunga durata passare sintonizzato stimolo ad un'intensità di stimolo 6 mV / cm, aumentando il numero di picchi al ripetizione come stimolo durata aumenta (Figura 5C). La media primo picco di latenza è 4.28 ± 0.16 msec, coerente con la latenza prevista per le piccole cellule in ELA 11. Figura 1. Specifiche per una camera di registrazione che può andare bene sotto l'obiettivo di un microscopio epiflourescent fisso stadio. (A) camera di registrazione quadrati a scala fatta di plexiglass che mostra vista superiore, laterale e posteriore. Gruppi accoppiati di elettrodi stimolanti (asterischi) alla periferia permettono sia trasversale (rosso-nero) o stimolazione longitudinale (blu-giallo). Un pezzo aggiuntivo di plexiglass in un angolo, con un foro in gomma rivestita in centro (arancione),detiene una pipetta di aspirazione che mantiene un livello d'acqua costante. Due pali in acciaio inox verticali avvitati nel fondo della camera (verde fisso) si connettono a pali in acciaio inox (contorno verde) collegati alla piattaforma di sostegno del pesce (grigio chiaro, dettagliato in C) tramite morsetti a disco regolabili. Una fotografia della camera di seguito si riporta il disegno di scala. (B) viste individuali e montati dei morsetti circolari a disco in plastica utilizzati per fissare la piattaforma per i montanti verticali. Ogni morsetto disco ha una scanalatura (verde) per un post e un foro centrale per la vite di serraggio. Morsetti a disco sono ruotate in modo che i solchi perpendicolari tra loro. Serrando la vite (rosso) fascette i posti in atto per prevenire ulteriori verticale e il movimento di rotazione della piattaforma. (C) viste a scala frontale e laterale della piattaforma plexiglass utilizzato per contenere il pesce sul posto. La piattaforma è rivestita con uno strato di cera di paraffina (blu) che contiene dowe legnols (barre nere) in grado di sostenere il pesce. Tubi per respirating il pesce passa attraverso un foro nel 'testata' della piattaforma e termina in una punta di pipetta posizionato nella bocca del pesce. Un palo di acciaio testa inox (barra grigia) si connette alla piattaforma tramite un giunto a sfera che permette la rotazione di 360 gradi. Messaggi orizzontali in acciaio inox (verde) sono avvitati due estremità della piattaforma. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 2. Schema di chirurgia guardando la superficie dorsale della testa. (A) Fare quattro tagli, nell'ordine indicato, per rimuovere un pezzo rettangolare di pelle (rosso). (B) Estendere l'apertura anteromedialmente per rimuovere un pezzo rettangolare supplementare della pelle (verde). (C) Raschiare eventuali residui di grasso o legamenti daspostando la lama di bisturi come indicato dalla freccia e asciugare completamente la superficie con Kimwipes e aria forzata. (D) Colla un alberino dell'acciaio inossidabile al cranio con Super Glue. Barra di scala in A vale per AD. (E) Utilizzare un trapano dentistico per fare quattro tagli, nell'ordine indicato, per rimuovere un pezzo rettangolare di osso (blu), esponendo i nuclei exterolateral anteriore e posteriore (ELA e ELP, rispettivamente) . Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 3. Marcatura fluorescente nel nucleo exterolateral posteriore 3 ore dopo l'iniezione di destrano coniugato con Alexa Fluor 568. (A) I nuclei exterolateral anteriore e posteriore (ELA e ELP, rispettivamente) visualizzata con illuminazione in campo chiaro dall'alto. Notache l'ampio mielinizzazione entro ELA conferisce un aspetto relativamente brillante che la distingue da ELP. (B) La stessa area visualizzata utilizzando epifluorescenza visto attraverso un filtro TRITC. (C) Una immagine unita usando blu di A (campo chiaro) e rosso per B (TRITC). (D) Esempio di un disegno in scala di ELA e ELP compresi i vasi sanguigni principali (linee rosse) che possono essere utilizzati come punti di riferimento per individuare la posizione esatta del etichettati assoni visibili solo sotto forte ingrandimento (la posizione esatta dei vasi sanguigni varia da pesce a pesce). La linea tratteggiata indica il confine tra ELA e ELP. (E) Esempi di immagini acquisite utilizzando un filtro TRITC da 5 diverse preparazioni che illustrano una serie di modelli di successo in materia di etichettatura di piccoli assoni delle cellule e Somas in ELA. Figura 4. Singola unità di registrazione extracellulareda un assone etichettato. (A) elettrodo di registrazione (punta di freccia) sotto pressione positiva collocata adiacente ad un piccolo assone cella etichettata in ELA (in alto) registra solo bordo artefatto (punte di freccia), in risposta a un 100 msec 20 mV / cm monofasici, controlaterale-positivo, impulso quadrato trasversale (in basso). (B) Rilasciando pressione verso l'esterno dall'elettrodo (testa di freccia) causa l'assone di spostare leggermente verso l'elettrodo (top) ma ci sono ancora nessuna risposta allo stimolo (in basso). ( C) pressione negativa Lieve tira l'assone in elettrodo (in alto, punta di freccia) e potenziali d'azione in risposta a stimoli esordio sono ora visibili (in basso, asterisco). Porzioni di fondo di tutti e tre i pannelli sono risposte sovrapposti a 20 ripetizioni dello stimolo. Figura 5. Rappresentante dei risultati con questa tecnica. (A) 5 tracce di esempioche mostra i potenziali d'azione evocati da una 0,1 msec 6 mV / cm monofasici, controlaterale-positivo, trasversale stimolo impulso quadrato. (B) trama raster che mostra gli orari picco nel corso di 20 ripetizioni di una finestra di registrazione di 75 msec per la stessa unità stimolato al tempo 0 con 6 mV / cm stimoli alla gamma di durate elencate a destra. (C) curva di accordatura Durata quantificare le risposte visualizzate nel raster come picchi al stimolo ripetizione. Massa (g) Lunghezza della forcella (cm) Profondità del corpo (cm) Significare 2.42 6.20 1.14 Deviazione standard 0.64 0.52 0.18 Gamma 1,2-4,0 5,5-8,4 0,9-1,6 Tabella 1. Ottimaleprofondità peso, lunghezza e profondità compresa corpo per i pesci. peso ottimale, lunghezza della forcella (punta del muso alla forcella di pinna caudale) e corpo (massima distanza dorso-ventrale nel piano trasversale) varia permettendo di pesce per adattarsi alla camera di registrazione illustrata nel figura 1. Pesci che sono troppo piccoli può essere meno probabilità di sopravvivere alla chirurgia e avrà un piccolo ELP, rendendo il posizionamento colorante impegnativo. Pesci che sono troppo grandi avrà un grande, cervelletto più ampio respiro in grado di ridurre l'accesso ai ELA e Elp e può impedire l'abbassamento della potenza, obiettivo di alta acqua-immersion abbastanza vicino a concentrarsi su ELA e Elp. Applicazione del sito Dye Tipo Pesce tentò Etichetta in ELA Etichetta in Elp Unità di tentato Registrazioni ELun Alexa Fluor iniezione 32 26 (81.2%) 19 (59.4%) 50 4 (8,0%) ELA Alexa Fluor imbevuto carta da filtro 1 0 0 0 0 ELA Di-I in DMSO 8 6 (75,0%) 0 0 0 ELA Di-O cristalli 5 3 (60,0%) 2 (40,0%) 9 0 Elp Solid Alexa Fluor cristalli 2 0 2 (100%) 0 0 Elp Alexa Fluor fili di tungsteno rivestiti 43 <strong> 29 (67,4%) 41 (95,3%) 119 26 (21,8%) Tabella 2. Le percentuali di successo per ogni metodo di iniezione di colorante. Tassi di successo per ogni metodo di iniezione di colorante. Metodi sono divisi in base ai sito di iniezione e tipo di colorante. Per ogni metodo, il numero totale dei pesci di tentativo e la percentuale di questi esperimenti che ha provocato l'etichettatura successo in ELA e Elp è mostrato. Notare che l'area di registrazione mirata è l'opposto del sito di applicazione (caselle in grassetto). Per il sito di iniezione, l'assorbimento colorante è stato considerato di successo con l'etichettatura di entrambi somas e assoni. In contrasto, nel sito di registrazione, solo preparazioni assoni etichettati stati contati come esperimenti di etichettatura di successo. Vengono visualizzati anche il numero totale di unità di tentativi e la percentuale di queste unità che ha portato in registrazioni di successo. # Di iniezione scTES Volume medio di iniezione (ml) Gamma di volumi per iniezione (ml) Volume di iniezione totale media (ml) Gamma di volumi di iniezione totale (ml) Microinjector con Hamilton 3 o 4 0.144 ,091-0,91 0.516 0,378-0,669 Nanoinjector con pipetta di vetro 2 – 4 0,069 (fisso) Volume fisso iniettato 1-6 volte 0,621 0,414-0,966 Microiniettore con pipetta di vetro 2-6 0.093 0,058-0,202 0.360 ,252-,540 Tabella 3. Quantitativi di tintura usato per ciascuno dei tre metodi usati per iniettare Alexa Fluor in ela quantità di tintura usato per ciascuno dei tre metodi utilizzati per iniettare Alexa Fluor in ELA (primo metodo da tabella 2). Iniezione di mezzo di contrasto in ELA è stata eseguita sia con un nanoinjector e un microinjector utilizzando un 33 gauge siringa Hamilton ago o un bicchiere pipetta capillare tirato. Abbiamo variato il numero di siti di iniezione, il volume per iniezione e il volume totale di iniezione di colorante.