Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

1. Dish Preparation Rätter som används för bit kultur är glasbottnad (med ett täckglas som bas) (WillCo rätter). Dessa placeras på linsen vävnad i en 6 cm vävnadsodlingsplatta för att hålla glaset botten ren. På dagen före experimentet, tillsätt 2 ml 0,1% poly-L-lysinlösning till glaset bottenförsedda skålen och inkubera under 5 min vid rumstemperatur för att tillåta den poly-L-lysin för att belägga glaset botten. Ta bort poly-L-lysin lösning och skölj tre gånger i avjoniserat vatten och därefter en gång i 70% etanol. Låt torka över natt. Rätter kan också torkas genom en försiktig uppvärmning i mikrovågsugn på låg effekt i 30-45 sekunder. 2. Embryo Elektroporering Inkubera ägg vid 37 ° C till Hamburger-Hamilton (HH) steg 10 (≈ 36 timmar) (eller annan önskad scenen). Innan du börjar förbereda glas nålar (vi använder en Flaming / Brun Modell p87 mikrokapillär avdragare) och bryta spetsen av needle med användning av en fin pincett under ett dissektionsmikroskop. I slutet av nålen bör vara tillräckligt skarp för att genomtränga embryot utan att ha ett så smalt att det hindrar injektion av DNA-lösningen. Fönster ägg och elektroder ställe (5 mm från varandra) på vardera sidan av embryot Införa DNA (~ 0,025 till 0,5 pg / pl i avjoniserat vatten färgas med en liten mängd av snabb grönt) i det neurala röret. Tillämpa gällande – 12-17 V tre gånger, 50 ms pulslängd med 950 ms mellan pulserna. Vi använder låga koncentrationer av DNA och låga spänningar elektroporation för att uppnå mosaik uttryck så att vi kan följa enskilda celler. Täck fönster i äggskalet med cellotape och kontrollera att den är förseglad. Tillåta embryona att återhämta sig under 3-4 timmar eller över natten vid 37 ° C. 3. Kollagen och skiva kultur Medium Förberedelser Förbered kollagen mix och skiva odlingsmedium cirka en timme före skivning. Till 300 | il typ 1 kollagen tillsätt 100 pl 0,1% ättiksyralösning och 100 | il 5 x L15-medium. Vortex noggrant efter varje tillsats. Lösningen ska gulna. Nu lägga 15-20 il 7,5% natriumbikarbonat och grundligt vortex. Lösningen bör bli svagt rosa, och volymen av natriumbikarbonat som krävs för detta kan variera. Håll på is och fyll upp nytt varje gång. Till 10 ml Neurobasal-medium tillsätt B-27 komplement och Glutamax, att en 1 x slutlig koncentration och 10 | il gentamicinlösning. Ställe medium i en 37 ° C inkubator buffrad med 5% CO2. Lämnar den övre delen av behållaren lös för att tillåta den att utjämnas mot CO2. 4. Slice Kultur Ta bort embryon från ägg och tvätta i L15 medium. Rum i en vävnadsodlingsskål med ett skikt av Sylgard vid botten och stift dem genom de omgivande extra embryonala membranen så att de sträcks spänd. Använda en mikrofonroknife, skiva embryot så rak som möjligt genom regionen av intresse. För ryggmärgen bör skivor ligga mellan 1-2 somiter tjocka. Låt skivor knutna till embryo medan du skär andra embryon så att du inte förlorar dem. Framställa en 200 pl mikropipett spets genom att skära av ~ 1 mm av spetsen och fästa detta till ett p2 eller p10. Denna spets kommer att användas för att överföra ryggmärgsskivor till glaset nedre skålen. En 10 pl tips är att inte tillräckligt bred för att plocka upp skivor. Belägga insidan av spetsen med kollagen genom att pipettera 1 il kollagen blandning framställdes sedan. Låt stå i 1-2 minuter och skölj sedan med L15 medium. Detta kommer att förhindra att vävnaden från att klibba fast på insidan av spetsen. Ta bort skiva från embryo med hjälp av en microknife och ta bort från skålen med en P2 eller P10 utrustad med en 200 fil spets och satt till 1 fil. Försök att ta upp så lite medium som möjligt. Vortex kollagen mixen och släpp 5-8 pl av denna vidare till poly-L-lysin belagd skålen. Omedelbart tas embryot skiva i kollagen och position på plats med ett par av fin pincett. Skivorna bör placeras så att den sida som skall avbildas ligger i plan med täckglas. Vävnaden bör vidhäfta till poly-L-lysin beläggning på täckglaset. Upprepa detta tills du har flera skivor på täckglaset. Vi kan vanligtvis rum 6-9 skivor på ett fat. När alla skivorna är på plats skall den omfatta skålen och tillåta kollagen för att ställa i 20 minuter. En del av den placerade tidigaste kollagenet kan redan ha börjat torka ut. För att förhindra detta lägger en liten mängd L15 dessa innan du täcker. Väl inställd, tillsätt försiktigt 2 ml medelstora bit kultur som har jämviktats i 5% CO 2 vid 37 ° C under minst en timme. Försiktighet måste vidtas för att inte rubba det kollagen från täckglaset. Rum i en 37 ° / 5% CO2 inkubator och tillåta skivorna återhämta sig under minst 3 timmar innan avbildning. Om det inte finns någon fukt, placera skålen i en plexiglaslåda humorha lite fuktigt papper i ett hörn. 5. Imaging Embryo Slices Vi använder en DeltaVision kärna brett fält mikroskop utrustat med en väderstation miljö kammare för bild skivor. Kammaren bibehålls konstant vid 37 ° C, med en CO-2 perfusionsapparat att bibehålla mikroskopställningen vid 5% CO2 / 95% luft. Imaging utförs normalt med en 40 x / 1,30 NA objektiv oljeimmersion och bilder tagna med en CoolSnap HQ2 kyld CCD-kamera. Z-sektioner tagna var 1,5 | im genom 45 ^ m vävnad. Exponeringstid bör hållas så låg som möjligt. Vi utsätter normalt 5-50 ms för varje Z-sektion. Bilderna är tagna var 7 minuter och upp till 9 skivor kan besökas med DeltaVision systemets exakt punkt besök funktion. 6. Representativa resultat Ett exempel tidsförlopp sekvens av en ryggmärg progenitorcell ärvisas i Fig.. 2a och motsvarande Film 1. Imaging startades på en ryggmärg skiva från en två dagar gammal (HH steg 12) embryo. Denna cell transfekterades med en konstruktion som uttrycker GFP-αTubulin. Under detta tidiga skede, neurala stamceller genomgår huvudsakligen stamfader-progenitorceller mode divisioner under vilken cellerna delar för att generera ytterligare två celler cykling stamceller. Figur. 2b och motsvarande Movie 2 visar en cell transfekterad med GFP-GPI (GPI förankrade GFP), som markerar cellmembranet. Denna cell genomgår en delning under vilken basala processen delas upp i två och är lika ärvs av dottern cellerna. Figur 1. Slice kultur protokoll för time-lapse avbildning. Figur 2. Cellen behavior under normal ryggmärg utveckling. (a) Utvalda bilder från film 1. Cell som uttrycker GFP-tubulin delar med en klyvning plan som är vinkelrätt mot den apikala ytan (2 h 20 min), vilket genererar två dotterceller som delar återigen (24 h 23 min och 25 h 54 min). (B) Utvalda bilder från Movie 2. Cell transfekterad med GFP-GPI genomgår celldelning under vilken basala processen delas (vita pilar) och lika ärvs av dottern cellerna. Film 1. Klicka här för att se filmen . Movie 2. Klicka här för att se filmen .