Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

1. Dish Preparazione I piatti utilizzati per la cultura slice sono il fondo di vetro (con un coprioggetto come base) (piatti WillCo). Questi sono posizionati sul tessuto lente in un piatto tessuto 6 centimetri cultura per mantenere il fondo di vetro pulito. Il giorno prima dell'esperimento, si aggiungono 2 ml 0,1% di poli-L-lisina soluzione al fondo piatto di vetro e incubare per 5 min a temperatura ambiente per permettere la poli-L-lisina per rivestire il fondo di vetro. Rimuovere poli-L-lisina soluzione e sciacquare tre volte in acqua deionizzata, e poi una volta in 70% etanolo. Lasciare asciugare per una notte. I piatti possono anche essere asciugati con blando riscaldamento in un forno a microonde a bassa potenza per 30-45 secondi. 2. Embryo Elettroporazione Incubare le uova a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) stage 10 (circa 36 ore) (o altro livello a scelta). Prima di iniziare la preparazione aghi di vetro (usiamo un Flaming / modello di Brown p87 puller microcapillare) e rompere la punta del needle utilizzando una pinza sottile sotto un microscopio da dissezione. La fine dell'ago dovrebbe essere abbastanza sottili da perforare l'embrione, pur non essendo così stretta che impedisce l'iniezione della soluzione di DNA. Uova finestra ed elettrodi (5mm posto a parte) su entrambi i lati dell'embrione Iniettare DNA (~ 0,025-0,5 pg / pl in acqua deionizzata colorato con una piccola quantità di verde veloce) nel tubo neurale. Applicare corrente – 12-17 V tre volte, lunghezza di impulso 50ms con 950 ms tra gli impulsi. Usiamo basse concentrazioni di DNA e delle tensioni di elettroporazione basse per ottenere l'espressione del mosaico in modo da poter seguire le singole celle. Coprire finestra nel guscio con cellotape e assicurarsi che sia sigillato. Lasciare embrioni di recuperare per 3-4 ore o durante la notte a 37 ° C. 3. Il collagene e Cultura Preparazione Slice Media Preparare mix collagene e terreno di coltura fetta circa un'ora prima di affettarlo. A 300 t plipo 1 collagene aggiungere 100 microlitri soluzione 0,1% di acido acetico e 100 pl 5 x L15 mezzo. Vortex accuratamente dopo ogni aggiunta. La soluzione dovrebbe diventare gialla. Ora aggiungere bicarbonato di 15-20 microlitri di sodio 7,5% e completamente vortice. La soluzione dovrebbe diventare leggermente rosa, e il volume di bicarbonato di sodio richiesti per questo può variare. Tenere su ghiaccio e portare fresca ogni volta. Per aggiungere 10 ml di terreno neurobasal B-27 e integratore Glutamax, ad una concentrazione finale di 1 x soluzione di Gentamicina e 10 pl. Luogo in media a 37 ° C incubatore tamponata con il 5% di CO 2. Lasciare la parte superiore del contenitore allentata per consentire equilibrare con la CO 2. 4. Slice Cultura Rimuovere gli embrioni da uovo e lavare in media L15. In un piatto di coltura tissutale con uno strato di Sylgard sul fondo e perno fuori attraverso i circostanti extra-embrionali membrane in modo che siano ben teso. Utilizzo di un microfonoroknife, embrione fetta più diritta possibile attraverso la regione di interesse. Per il midollo spinale, fette dovrebbe essere compreso tra 1-2 somiti spessore. Lasciare collegati a fette embrione mentre si affettare altri embrioni in modo da non perderli. Preparare una punta di 200 microlitri micropipetta tagliando ~ 1 mm della punta e allegando ad un p2 o p10. Questa punta verrà utilizzato per trasferire le fette midollo spinale al fondo piatto di vetro. A 10 microlitri punta non è sufficientemente ampio per raccogliere fette. Rivestire l'interno della punta con il collagene pipettando 1 mix ul collagene preparato in precedenza. Lasciare agire per 1-2 minuti e poi risciacquare con L15 media. Ciò impedirà il tessuto si attacchi all'interno della punta. Staccare fetta dall'embrione utilizzando una microknife e togliere dal piatto con un p2 p10 o munito di una punta 200 pl e impostare a 1 microlitri. Prova di prendere come mezzo meno possibile. Il collagene mix e goccia Vortex 5-8 pl di questa al poli-L-lisina piatto rivestito. Immediatamente messo fetta embrione in collagene e la posizione in posizione con un paio di pinze sottili. Fette devono essere posizionati in modo che il lato di essere ripreso è a filo con il coprioggetto. Il tessuto deve aderire al poli-L-lisina rivestimento sul vetrino. Ripetere questa operazione finché non avrete fette più sul vetrino. Di solito possiamo mettere 6-9 fette su un piatto. Una volta che tutte le fette sono in posizione, coprire il piatto e permettono di impostare il collagene per 20 minuti. Alcuni dei primi collagene posto potrebbe essere già iniziato ad asciugarsi. Per evitare questo aggiungere una piccola quantità di L15 a questi prima copertura. Una volta impostata, aggiungere cautamente 2ml terreno di coltura fetta che è stata equilibrata in 5% CO 2 a 37 ° C per almeno un'ora. Bisogna fare attenzione a non staccare il collagene dal vetrino. Posto a 37 ° / 5% CO 2 incubatore e consentire fette di recuperare per almeno 3 ore prima di imaging. Se non c'è, piatto di umidità posto in uno spirito box perspexha bit di carta velina umida in un angolo. 5. Imaging embrioni Slices Usiamo un Core DeltaVision ampio campo ottico dotato di una camera Weatherstation ambientale fette di immagine. La camera è mantenuta costantemente a 37 ° C, con CO 2 apparato perfusione di mantenere la fase microscopio al 5% CO 2/95% aria. Imaging viene normalmente eseguita con un 40 x / NA 1,30 Olio per lenti ad immersione e le immagini vengono catturate con un HQ2 CoolSnap raffreddato camera CCD. Z sezioni vengono catturati ogni 1,5 um a 45 um tessuto. Il tempo di esposizione deve essere mantenuto il più basso possibile. Di solito esporre per 5-50 ms per ogni Z-sezione. Le immagini vengono catturate ogni 7 minuti e fino a 9 sezioni può essere visitata utilizzando il punto preciso del sistema DeltaVision di visita funzione. 6. Risultati rappresentativi Un time-lapse sequenza di esempio di una cellula progenitrice midollo spinale èmostrato nella fig. 2a e Movie corrispondente 1. Imaging è stato avviato su una fetta del midollo spinale da una due-giorni di età (HH stage 12) dell'embrione. Questa cella è stata transfettata con un costrutto che esprime GFP-αTubulin. Durante questa prima fase, le cellule progenitrici neurali subiscono prevalentemente progenitrice progenitrici divisioni-mode durante il quale le cellule si dividono per generare due cellule progenitrici ulteriori ciclismo. Fig. Film 2b e corrispondente 2 mostra una cellula trasfettata con GFP-GPI (ancorata a GPI GFP), segna la membrana cellulare. Questa cellula subisce una divisione durante il quale il processo basale si divide in due ed è ugualmente ereditato dalle cellule figlie. Figura 1. Slice protocollo di cultura per time-lapse imaging. Figura 2. Cellule Behavior durante il normale sviluppo del midollo spinale. (a) i fotogrammi selezionati da Movie 1. Cellulari esprimenti GFP-tubulina divide con un piano di clivaggio che è perpendicolare alla superficie apicale (2 h 20 min), generando due cellule figlie che dividono ancora una volta (24 h 23 min e 25 h 54 min). (B) i fotogrammi selezionati da Movie 2. Cellule trasfettate con GFP-GPI subisce divisione cellulare in cui è suddiviso il processo basale (frecce bianche) e ugualmente ereditato dalle cellule figlie. Movie 1. Clicca qui per vedere il film . Movie 2. Clicca qui per vedere il film .