उच्च संकल्प विकास Neuroepithelium में सेल व्यवहार का लाइव इमेजिंग
Summary
इमेजिंग वास्तविक समय में भ्रूण ऊतक समय की लंबी अवधि में चुनौती दे रहा है. यहाँ हम उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ लंबी अवधि के लिए सेलुलर और उप सेलुलर लड़की रीढ़ की हड्डी में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक परख मौजूद है. इस तकनीक तंत्रिका तंत्र और विकासशील भ्रूण के अन्य क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
भ्रूण तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) की neuronal और glial कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत को जन्म दे साइकिल की रीढ़ की हड्डी होते हैं. हालांकि ज्यादा आणविक है कि रीढ़ की हड्डी पैटर्न तंत्र के बारे में जाना जाता है और neuronal 1 भेदभाव, 2 प्रकाश में लाना है, हम सेल व्यवहार के स्तर पर इन प्रारंभिक घटनाओं की एक गहरी समझ की कमी है. यह इस प्रकार वास्तविक समय में तंत्रिका progenitors के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में वे neurogenesis से गुजरना है.
अतीत, जल्दी भ्रूण ऊतक के वास्तविक समय इमेजिंग / कोशिका ऊतक संस्कृति में व्यवहार्यता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट इमेजिंग के phototoxic प्रभाव सीमित कर दिया गया. यहाँ हम इमेजिंग समय की लंबी अवधि के लिए इस तरह के ऊतक के लिए एक उपन्यास परख वर्तमान में, एक उपन्यास पूर्व vivo टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल और व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि (1) का उपयोग. यह दृष्टिकोण लड़की भ्रूण है की लंबी अवधि के समय चूक निगरानी प्राप्तPinal उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ गर्भनाल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं.
(पायदान 5 संकेतन, उदाहरण के लिए) यह परख सेलुलर और उप सेलुलर व्यवहार उपन्यास के विकास और जीन गतिविधि के लिए अत्यधिक संवेदनशील संवाददाताओं से अवलोकन करने के लिए इसके अलावा भ्रूण 3 ऊतकों, 4 की एक सीमा छवि के लिए संशोधित किया जा सकता है इस परख करता है साथ जो समझने के लिए कैसे संकेत एक शक्तिशाली उपकरण भ्रूण विकास के दौरान सेल व्यवहार को नियंत्रित करता है.
Protocol
Discussion
हम यहाँ एक उपन्यास इमेजिंग समय चूक परख वर्तमान चिकन भ्रूण टुकड़ा संस्कृति में सेल के व्यवहार पर नजर रखने. इस परख के लिए 70 घंटे तक जीवित ऊतक के उच्च संकल्प इमेजिंग में सक्षम बनाता है, हालांकि 24-48 घंटे के बीच समय फ्रेम पर कब्जा करने में आसान हैं. एक उच्च एनए तेल उद्देश्य और अपेक्षाकृत कम समय अंक के बीच अंतराल के उपयोग उच्च संकल्प छवि अधिग्रहण के लिए सक्षम बनाता है, के रूप में हमें सेल व्यवहार है कि अक्सर तेजी से होता है पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है के रूप में अच्छी तरह से, और आसानी से पारंपरिक समय चूक confocal का उपयोग इमेजिंग के दौरान याद कर सकते हैं माइक्रोस्कोपी.
इस परख के प्रमुख लाभ छवि कोशिकाओं के लिए समय की लंबी अवधि से अधिक क्षमता है. व्यापक क्षेत्र confocal 7 माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर की बजाय 6 का उपयोग इस के लिए महत्वपूर्ण है. Confocal माइक्रोस्कोपी पारंपरिक रूप से व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी पर कई फायदे की पेशकश करने के लिए ऑप्टिकल वर्गों लेने और ध्यान केंद्रित जानकारी के बाहर सीधे को खत्म करने की क्षमता सहित, <sup> 7, लेकिन एक pinhole का उपयोग 8 डिटेक्तार के लिए प्रकाश की एक नुकसान होता है, जानकारी का एक महत्वपूर्ण राशि को छोड़कर, और अब जोखिम बार की जरूरत महसूस. व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, दूसरे हाथ पर, पूरा क्षेत्र रोशनी का उपयोग करता है और उद्देश्य के माध्यम से प्रकाश गुजर डिटेक्टर को भेजा जाता है. एक उच्च मात्रा दक्षता के साथ युग्मित युग्मित डिवाइस (सीसीडी) शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत confocal माइक्रोस्कोपी, 9 बहुत तेजी से जोखिम समय के साथ तुलना के साथ कैमरा इमेजिंग सुनिश्चित करता है ठंडा. हमारे आवेदन में, हम लंबी अवधि के रिकॉर्ड 3 डी के ढेर और अंततः छोटे – पास – विवर्तन सीमित संरचनाओं को हल करने के लिए छवि चाहिए. हालांकि confocal माइक्रोस्कोपी कभी डिटेक्टर तक पहुँचने से बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश रोकता है और इस प्रकार काफी मोटी, घनी लेबल 7 नमूने, 8 में पृष्ठभूमि को कम कर देता है, केवल यह बहुत बड़ा प्रकाश से इनपुट के साथ एक उपयोगी संकेत करने के लिए शोर अनुपात को प्राप्त व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी 10. बहुत प्रकाश के प्रति संवेदनशील sparsel के लिएजैसे हमारे electroporated रीढ़ की हड्डी की स्लाइस वाई लेबल नमूने, इसलिए, व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी confocal माइक्रोस्कोपी से बेहतर प्रदर्शन. जब deconvolution द्वारा छवि बहाली साथ संयुक्त है, जो फोकस जानकारी के बाहर निकालता है और इसके विपरीत में सुधार, व्यापक क्षेत्र है तो छोटे, मंद 11 वस्तुओं का पता लगाने के लिए विशेष रूप से अच्छा है. हर ऊतक इमेजिंग प्रयोग के लिए उपयुक्त नहीं है हालांकि, इस दृष्टिकोण बहुत प्रभावी है, हमारे जीवित कोशिका इमेजिंग आवेदन के लिए किया गया है.
फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चुनाव एक महत्वपूर्ण कारक है कि सेल अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है. हम पाते हैं कि सबसे अच्छा परिणाम constructs कि एक मार्कर के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 12 (GFP) के उपयोग से प्राप्त कर रहे हैं. वर्तमान में हम लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि प्रभावी ढंग से दोहरी चैनल समय – खामियों के लिए GFP साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है की एक सीमा का आकलन कर रहे हैं. वहाँ में 13 उपलब्ध प्रोटीन की एक किस्म है. हालांकि कई प्रोटीन fusions के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ स्थिर रहे हैंकुछ प्रोटीन संलयन द्वारा अस्थिर गाया जा सकता है, कम सेल व्यवहार्यता में जिसके परिणामस्वरूप. ऐसे मामलों में, एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) युक्त constructs का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन से ब्याज की प्रोटीन को अलग करने के लिए उपयोगी है.
जब इमेजिंग रीढ़ की हड्डी की स्लाइस, देखभाल करने के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए जोखिम को कम लिया जाना चाहिए. खुर्दबीन eyepieces प्रेषित प्रकाश (brightfield) के साथ ही इस्तेमाल किया जाना चाहिए पता लगाने और स्थिति स्लाइस. फ्लोरोसेंट छवियों हमेशा माइक्रोस्कोप का उपयोग कम से कम जोखिम बार के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर हासिल किया जाना चाहिए. इन 5-50 एमएस के रेंज में रखा जाना चाहिए और तटस्थ घनत्व फिल्टर के उपयोग के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए. हालांकि अब जोखिम बार शुरू में स्पष्ट छवियों का उत्पादन कर सकते हैं, फ्लोरोसेंट रोशनी जोखिम के phototoxic प्रभाव कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. ऊतक के पहले 5-10 माइक्रोन कि coverslip के सबसे करीब है के रूप में इस क्षेत्र के ऊतकों है कि के दौरान किया गया है क्षतिग्रस्त हो सकता है शामिल नहीं किया जा imaged किया जाना चाहिएटुकड़ा करने की क्रिया.
एचएच 10 मंच और छवि 6-7 घंटे बाद में electroporated भ्रूण के उदाहरण यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं, हालांकि इस विधि भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अप करने के लिए 18 चरण HH. बाद के चरणों में, रीढ़ की हड्डी ऊतक बहुत बड़ा है और इसलिए हाथ से टुकड़ा करने के लिए मुश्किल है. इन मामलों में, कम पिघलने बिंदु agarose में भ्रूण एम्बेड और एक vibratome साथ सेक्शनिंग बेहतर परिणाम उपज हो सकती है. हालांकि हम विकासशील रीढ़ की हड्डी में इमेजिंग कोशिकाओं के लिए एक पद्धति के रूप में इस परख मौजूद है, इस दृष्टिकोण भी छवि को संवेदी 3 placodes सहित अन्य भ्रूण के ऊतकों, के लिए संशोधित किया गया.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| WillCo Dish | WillCo Wells | GWst-3522 | |
| poly-l-lysine | Sigma | P8970 | 0.1% in Tris |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Instruments | GC100-10 | 1.0mm outer diameter, 0.58mm inner diameter |
| Electrodes (Genetrodes, in ovo, L-shaped | BTX | 10-001850-01 | 5mm gold plated |
| ECM 830 square pulse generator | BTX | 45-0002 | for in ovo electroopration |
| Fast Green | Sigma | F7258 | |
| Type I rat collagen | Sigma | C3857 | |
| L-15 medium (powder) | Sigma | 2.76 g/L in distilled water for 5x solution |
|
| Sodium bicarbonate | Sigma | S8761 | 7.5% solution |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348-017 | without phenol red |
| Glutamax | Invitrogen | A1286001 | 100x solution |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710049 | 10 mg/ml |
| L15 medium (liquid 1x) | Invitrogen | 11415-049 | |
| Microknife | Altomed | A10102 | 15 degree incline |
| Stainless steel headless pins | Watkins and Doncaster | E6871 | A1 size |
| Sylgard 184 elastomer | VWR | 634165S | |
| DeltaVision Core microscope system | Applied Precision | ||
| Coolsnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
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