Imagerie à haute résolution en direct du comportement des cellules dans le développement neuro-épithélium

1. Préparation de la vaisselle Plats utilisés pour la culture tranche sont à fond de verre (avec une lamelle de la base) (plats WillCo). Ces derniers sont placés sur du tissu optique dans une boîte de culture tissulaire de 6 cm pour garder le fond de verre propre. Le jour avant l'expérience, ajouter 2 ml de 0,1% de poly-L-lysine solution au plat à fond de verre et incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour permettre à la poly-L-lysine recouvrir le fond de verre. Retirer la poly-L-lysine solution et rincer trois fois dans de l'eau désionisée, puis une fois dans l'éthanol à 70%. Laissez sécher une nuit. Les plats peuvent également être séché en chauffant légèrement dans un micro-ondes à faible puissance pendant 30-45 secondes. 2. L'électroporation d'embryons Incuber les œufs à 37 ° C à Hamburger-Hamilton (HH) étape 10 (~ 36 heures) (ou un autre stade de croissance désiré). Avant de commencer de préparer des aiguilles de verre (nous utilisons un Flaming / modèle de Brown p87 extracteur microcapillaire) et de rompre la pointe de l'needle à l'aide d'une pince fines sous une loupe binoculaire. La fin de l'aiguille doit être suffisamment pointu pour percer l'embryon tout en n'étant pas si étroite qu'elle entrave l'injection de la solution d'ADN. Oeufs de fenêtres et positionner les électrodes (5mm d'intervalle) de chaque côté de l'embryon Injecter de l'ADN (~ 0,025 à 0,5 ug / ul dans de l'eau déminéralisée coloré avec une petite quantité de vert rapide) dans le tube neural. Appliquer le courant – 12-17 V trois fois, la longueur d'impulsion 50ms avec 950 ms entre les impulsions. Nous utilisons de faibles concentrations d'ADN et des tensions d'électroporation bas pour obtenir l'expression de la mosaïque afin que nous puissions suivre les cellules individuelles. Couvrez la fenêtre dans la coquille d'oeuf avec scotch et assurez-vous qu'il est scellé. Laisser embryons de récupérer pendant 3-4 heures ou toute la nuit à 37 ° C. 3. Le collagène et de préparation moyen Slice Culture Préparer le mélange de collagène et d'un milieu de culture tranche d'environ une heure avant de trancher. Pour 300 t plype 1 collagène ajouter 100 ul solution à 0,1% d'acide acétique et 100 ml 5 x milieu L15. Vortex bien après chaque addition. La solution doit virer au jaune. Maintenant, ajoutez du bicarbonate de 15-20 pi de sodium à 7,5% et de manière approfondie vortex. La solution doit devenir légèrement rosée, et le volume de bicarbonate de sodium requise pour cela peut varier. Gardez sur la glace et maquillage frais à chaque fois. Pour 10 ml de milieu neurobasal ajouter B-27 supplément et Glutamax, à une concentration de 1 x final et une solution à 10 gentamicine ul. Lieu moyenne dans un incubateur à 37 ° C tamponnée avec 5% de CO 2. Laisser la partie supérieure du récipient lâche pour lui permettre de s'équilibrer avec le CO 2. 4. Culture Slice Retirer embryons à partir d'œufs et se laver dans du milieu L15. Lieu dans une boîte de culture tissulaire avec une couche de Sylgard au fond et les fixer à travers les entourant extra-embryonnaire de telle sorte que les membranes sont tendus. L'utilisation d'un microroknife, embryon tranche aussi droite que possible à travers la région d'intérêt. Pour la moelle épinière, des tranches doit être comprise entre 1-2 somites épais. Laissez tranches attachés à l'embryon pendant que vous coupez d'autres embryons afin de ne pas les perdre. Préparer une spatule 200 micropipette ul en coupant ~ 1 mm de la pointe et en joignant cette page à un p2 ou p10. Cette astuce va être utilisé pour transférer les tranches de la moelle épinière dans le plat à fond de verre. Un pourboire de 10 ul n'est pas assez large pour ramasser tranches. Manteau à l'intérieur de la pointe avec du collagène par pipetage 1 mix collagène ul préparé plus tôt. Laissez pendant 1-2 minutes, puis rincer à l'milieu L15. Cela permettra d'éviter le tissu de coller à l'intérieur de la pointe. Détachez tranche de l'embryon en utilisant un microknife et retirer de l'antenne en utilisant un p2 ou p10 munie d'une douille 200 pi et mis à 1 pl. Essayez de prendre place en tant que milieu le moins possible. Vortex du mélange de collagène et de goutte 5-8 pi de ce message à l'antenne de poly-L-lysine revêtu. ImmediaTely mis tranche embryon dans le collagène et la position en place avec une paire de pinces fines. Tranches doit être placé de sorte que le côté à imager est alignée avec la lamelle. Le tissu doit adhérer au revêtement poly-L-lysine sur la lamelle. Répétez jusqu'à ce que vous avez plusieurs tranches sur la lamelle. Nous pouvons généralement placer 6-9 tranches sur un plat. Une fois toutes les tranches sont en place, couvrir le plat et laissez le collagène de mettre pendant 20 minutes. Certaines des premières collagène placé peut-être déjà commencé à se dessécher. Pour éviter cela, ajoutez une petite quantité de L15 à ces avant de recouvrir. Une fois réglé, ajouter prudemment 2ml milieu de culture tranche qui a été équilibrée dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant au moins une heure. Des précautions doivent être prises pour ne pas déloger le collagène de la lamelle. Placer dans un 37 ° / 5% de CO 2 incubateur et permettent de récupérer les tranches pendant au moins 3 heures avant l'imagerie. S'il n'ya pas de placer le plat d'humidité, dans un esprit boîte de plexiglasha peu de papier absorbant humide dans un coin. 5. Tranches d'embryons d'imagerie Nous utilisons un Core DeltaVision grand champ microscope équipé d'une chambre de l'environnement StationMeteo à des tranches d'image. La chambre est maintenue constante à 37 ° C, avec un groupe CO 2 Dispositif de perfusion afin de maintenir la platine du microscope à 5% de CO 2/95% d'air. L'imagerie est normalement effectuée en utilisant un 40 x / 1,30 lentille à immersion d'huile et de NA images sont capturées avec un HQ2 Coolsnap refroidi caméra CCD. Z-sections sont capturés tous les 1,5 um à 45 um tissus. Le temps d'exposition doit être maintenue aussi basse que possible. Nous avons l'habitude d'exposer pour la 5-50 ms pour chaque section en Z. Les images sont capturées toutes les 7 minutes et jusqu'à 9 tranches peuvent être visités en utilisant le système de point précis DeltaVision de visiter fonction. 6. Les résultats représentatifs Un exemple en accéléré séquence d'une cellule progénitrice moelle épinière estFig. 2a et Movie 1 correspondant. L'imagerie a été commencé sur une tranche de la moelle épinière de deux jours-vieux (stade HH 12) embryon. Cette cellule a été transfectées avec une construction exprimant GFP-αTubulin. Au cours de ce stade précoce, les cellules progénitrices neurales subissent principalement les divisions de mode géniteur-souches au cours de laquelle les cellules se divisent pour générer deux autres cellules progénitrices du cyclisme. Fig. Film 2b et correspondant 2 montre une cellule transfectée avec GFP-GPI (GPI ancrées GFP), le marquage de la membrane cellulaire. Cette cellule subit une division au cours de laquelle le processus de base se divise en deux et est également hérité par les cellules filles. Figure 1. Protocole de culture Tranche d'imagerie time-lapse. Figure 2. B portableehavior au cours du développement normal de la moelle épinière. (a) les cadres sélectionnés à partir de Film 1. Cellule exprimant la GFP-tubuline divise avec un plan de clivage qui est perpendiculaire à la surface apicale (2 h 20 min), générer deux cellules filles qui divisent une fois de plus (24 h 23 min et 25 h 54 min). (B) les cadres sélectionnés à partir de Movie 2. Cellules transfectées avec GFP-GPI subit la division cellulaire au cours de laquelle le processus de base est divisé (flèches blanches) et également hérité par les cellules filles. Film 1. Cliquez ici pour voir le film . Movie 2. Cliquez ici pour voir le film .