عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية
Summary
تصوير الأنسجة الجنينية في الوقت الحقيقي هو تحدي على مدى فترات طويلة من الزمن. نحن هنا يقدم فحص لرصد التغيرات الخلوية وشبه الخلوية في الحبل الشوكي فرخ لفترات طويلة مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية. ويمكن تكييف هذه التقنية في مناطق أخرى من الجهاز العصبي والأجنة النامية.
Abstract
الحبل الشوكي الجنينية يتكون من ركوب الدراجات الخلايا الاولية العصبية التي تؤدي إلى نسبة كبيرة من الخلايا العصبية والدبقية من الجهاز العصبي المركزي (CNS). على الرغم من أن يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية التي نمط الحبل الشوكي والحصول على تمايز الخلايا العصبية 1، 2، أننا نفتقر إلى فهم عميق لهذه الأحداث في وقت مبكر على مستوى سلوك الخلية. وبالتالي فإن من الأهمية بمكان لدراسة سلوك من الأسلاف العصبية في الوقت الحقيقي، لأنها تخضع لتكوين الخلايا العصبية.
في تصوير الماضي في الوقت الحقيقي، من الأنسجة الجنينية في وقت مبكر كان محدودا من قبل خلية / نسيج البقاء في الثقافة، فضلا عن التأثيرات الضوئية من التصوير فلوري. هنا نقدم لفحص جديدة لتصوير الأنسجة مثل لفترات طويلة من الزمن، وذلك باستخدام المجراة سابقا رواية شريحة بروتوكول ثقافة واسعة حقل مضان المجهري (الشكل 1). هذا النهج يحقق طويل الأجل الوقت الفاصل بين رصد كتكوت الجنينية قبينال الخلايا الاولية الحبل مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية.
يجوز تعديل هذا الفحص صورة لمجموعة من الخلايا الجنينية 3، 4 بالإضافة إلى مراقبة السلوكيات الخلوية وشبه الخلوية، ووضع رواية والمراسلين حساسة للغاية للنشاط الجين (على سبيل المثال، يشير الى الشق 5) يجعل من هذا الفحص أداة قوية مع الذي يدل على فهم كيفية تنظيم سلوك الخلية أثناء التطور الجنيني.
Protocol
Discussion
نقدم هنا رواية فحص التصوير الوقت الفاصل بين لمراقبة سلوك الخلايا في ثقافة شريحة الدجاج الجنينية. هذا الاختبار تمكن ارتفاع القرار التصوير من الأنسجة الحية لمدة تصل إلى 70 ساعة، على الرغم من الأطر الزمنية بين 24-48 ساعة هي أسهل لالتقاط. استخدام هدفا ارتفاع النفط NA وفترات قصيرة نسبيا بين نقاط في الوقت يتيح الحصول على الصور بدقة عالية، فضلا عن السماح لنا بمراقبة سلوك الخلية التي غالبا ما يحدث بسرعة، ويمكن أن تضيع بسهولة خلال الوقت الفاصل بين التصوير التقليدي باستخدام مبائر المجهري.
والميزة الرئيسية لهذا الفحص هو القدرة على خلايا صورة على مدى فترات طويلة من الزمن. استخدام على نطاق ومجال 6 بدلا من ليزر متحد البؤر المسح 7 المجهري هو أمر حاسم لهذا. وعرضت متحد البؤر المجهري عادة العديد من المزايا واسعة المجال المجهري، بما في ذلك القدرة على اتخاذ المقاطع البصرية والقضاء عليها من معلومات التركيز مباشرة <sup> 7، ولكن استخدام الثقب يؤدي إلى فقدان للضوء كاشف على 8، باستثناء كمية كبيرة من المعلومات، ويستلزم مرات أطول من التعرض. واسعة المجال المجهري، من جهة أخرى، يستخدم كامل إضاءة الميدان، ويتم إرسال كل الضوء المار من خلال هدف للكشف. يبرد هذا إلى جانب وجود كفاءة عالية إلى جانب الكم جهاز (CCD) كاميرا التصوير يضمن مع إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء مقارنة متحد البؤر المجهري 9، مع أوقات التعرض سريع جدا. في تطبيق لدينا، يجب علينا صورة لفترات طويلة، وسجل مداخن 3D حل في نهاية المطاف الصغيرة القريبة من الحيود هياكل محدودة. على الرغم من متحد البؤر المجهري يمنع الخروج من تركيز الضوء من الوصول إلى أي وقت مضى للكشف، وبالتالي يقلل بشكل ملحوظ في خلفية سميكة عينات كثيفة المسمى، 7، 8، فإنه يحقق فقط صالحة للاستعمال إشارة إلى الضجيج نسبة مساهمة مع ضوء أكبر بكثير من واسعة المجهري حقل 10. لsparsel جدا حساسة للضوءعينات ص صفت لنا مثل electroporated شرائح النخاع الشوكي، وبالتالي، على نطاق ومجال المجهري أداء أفضل من متحد البؤر المجهري. عندما يقترن استعادة صورة بواسطة deconvolution، الذي يزيل من معلومات التركيز ويحسن النقيض من ذلك، واسعة المجال ثم جيدة خاصة للكشف عن الكائنات الصغيرة خافت 11. في حين لا تناسب كل الأنسجة تجربة التصوير، وكان هذا النهج فعالا للغاية لدينا خلية حية تطبيق التصوير.
اختيار بروتين فلوري هو عامل مهم يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية. نجد أن يتم الحصول على أفضل النتائج من التركيبات التي تستخدم البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) 12 كعلامة. ونحن حاليا بتقييم مجموعة من البروتينات الفلورية الحمراء التي يمكن استخدامها بشكل فعال في تركيبة مع GFP لقناة مزدوجة الوقت الهفوات. وهناك مجموعة متنوعة من البروتينات مثل متاح 13. على الرغم من أن العديد من البروتينات في حالة مستقرة كما اندماج مع بروتين فلوريقد يتم تقديم بعض البروتينات غير مستقر من قبل الانصهار، مما أدى إلى بقاء الخلية المنخفض. في مثل هذه الحالات، واستخدام التركيبات التي تحتوي على موقع داخلي دخول الريبوسوم (IRES) مفيد لفصل البروتين من الفائدة من بروتين فلوري.
عندما شرائح تصوير النخاع الشوكي، لا بد من توخي الحذر لتقليل التعرض لضوء الفلورسنت. يجب استخدام العدسات المجهر فقط مع الضوء المرسل (brightfield) لتحديد موقع وموقف شرائح. وينبغي دائما الصور فلوري سيتم شراؤها باستخدام برنامج المجهر باستخدام الحد الأدنى من التعرض مرات. يجب أن تبقى هذه في حدود 5-50 مللي، وينبغي أن جربت استخدام مرشحات الكثافة محايدة مع. على الرغم من أن التعرض لفترات زمنية أطول قد تنتج في البداية صور أكثر وضوحا، قد تكون تأثيرات الضوئية من التعرض للضوء الفلورسنت أن يؤدي إلى موت الخلية. لا ينبغي ميكرون 1 5-10 من الأنسجة التي هي الأقرب إلى ساترة كما يمكن تصوير هذه المنطقة تحتوي على الأنسجة التي قد تكون قد تضررت خلالتشريح.
على الرغم من أن الأمثلة المطروحة هنا هي من الأجنة في مرحلة electroporated سمو (10) والمصورة 6-7 ساعات في وقت لاحق، ويمكن استخدام هذه الطريقة لأجنة تصل إلى سمو المرحلة 18. في مراحل لاحقة، والأنسجة الحبل الشوكي هو أكبر من ذلك بكثير وذلك هو صعب لشريحة باليد. في هذه الحالات، قد غرس الأجنة في انخفاض ذوبان الاغاروز نقطة وباجتزاء مع vibratome تحقق نتائج أفضل. على الرغم من أننا تقديم هذا الاختبار كوسيلة للخلايا التصوير في الحبل الشوكي النامي، كما تم تعديل هذا النهج إلى الأنسجة الجنينية صورة أخرى، بما في ذلك placodes الحسية 3.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| WillCo Dish | WillCo Wells | GWst-3522 | |
| poly-l-lysine | Sigma | P8970 | 0.1% in Tris |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Instruments | GC100-10 | 1.0mm outer diameter, 0.58mm inner diameter |
| Electrodes (Genetrodes, in ovo, L-shaped | BTX | 10-001850-01 | 5mm gold plated |
| ECM 830 square pulse generator | BTX | 45-0002 | for in ovo electroopration |
| Fast Green | Sigma | F7258 | |
| Type I rat collagen | Sigma | C3857 | |
| L-15 medium (powder) | Sigma | 2.76 g/L in distilled water for 5x solution |
|
| Sodium bicarbonate | Sigma | S8761 | 7.5% solution |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348-017 | without phenol red |
| Glutamax | Invitrogen | A1286001 | 100x solution |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710049 | 10 mg/ml |
| L15 medium (liquid 1x) | Invitrogen | 11415-049 | |
| Microknife | Altomed | A10102 | 15 degree incline |
| Stainless steel headless pins | Watkins and Doncaster | E6871 | A1 size |
| Sylgard 184 elastomer | VWR | 634165S | |
| DeltaVision Core microscope system | Applied Precision | ||
| Coolsnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
- Ulloa, F., Briscoe, J. Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord. Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).
- Briscoe, J., Novitch, B. G. Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).
- Shiau, C., Das, R., Storey, K. An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis. BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis. BMC Biology. 9, 58 (2011).
- Herman, B. Fluorescence microscopy. Bios Scientific Publishers. , (1998).
- Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. . Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).
- Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).
- Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).
